2023年10月19日 ファイザー新型コロナワクチンとインフルエンザワクチンを同時接種
2023年10月24日 死亡をVAERSに報告
在米の中国人の分析を聞いていると、これは逆で、いかに中国へ投資したお金を中国外へ持ち出すかを画策しているという話。
投資会社は、上海に高額なビルを所有しており、中国共産党政府は、お金が国外へ動くことを困難にしているらしい。
NHKのニュースから
英国の子宮頸がんの統計も、更新が2年ストップしています。
2018年の論文で、核酸の修飾が、転写に与える影響を調べています。
修飾核酸は、以下の図にある5種類で、新型コロナワクチンで使用されたN1-メチルシュードウリジンはありませんが、シュードウリジンに関して興味深い結果が得られています。
実験は、適当な配列のDNAをテンプレートとしてT7ベクターを作って、これを、T7RNAポリメラーゼでmRNAに転写し、この時、修飾核酸を使用して、mRNAに修飾核酸を取り入れています。
できたｍRNAを、種々の逆転写酵素で逆転写してcDNAを生成、このcDNAをもう一度転写して、dsDNAを生成し、このdsDNAのエラーを調べています。
エラーは、T7RNAポリメラーゼによるｍRNAをへの転写反応で起こるものと、
mRNAからcDNAへの逆転写で起こるものと、
cDNAからdsDNAを合成するときにおこるものの3種類があります。
例えばシュードウリジンの場合、
rA→rU/dT→dAというエラーが、未修飾のmRNAに比較して12倍となっています。
この実験では、cDNAのエラーをみているので、T7ポリメラーゼのエラーか逆転写のエラーかの区別はすぐにはつきませんので、rA→rU/dT→dAと示しています。
このエラーのrA→rUは、テンプレートのAから作ったｍRNAのAがUに間違って転写されたということで、テンプレートの2本鎖DNAのマイナス鎖のTにU（シュードウリジン）が誤って会合してしまったということです。
dT→dAは、ｍRNAのAを逆転写するさいに、TではなくAに逆転写されたことを示しています。つまり、ｍRNAのAに、アデノシン（A）が会合してしまったということです。
実際には、この２つの可能性のひとつが起こっており、それは、エラーのパターンから判断し、シュードウリジンの場合は、T7RNAポリメラーゼによる転写反応でのエラーであることがわかりました。
これは、シュードウリジンの場合ですが、前回のブログで、N1-メチルシュードウリジンのエラーがシュードウリジンよりも一桁低い結果がでていましたが、DNAからRNAへの転写反応でのエラーは、産生されるタンパク質に多大な影響を及ぼすので、注視する必要があります。
特に、他の論文で、N1-メチルシュードウリジンが切断型の短いタンパク質を産生したという実験結果がありましたので、このエラーによって終止コドンが現れたのかどうかなどは考察するメリットがあると思いました。
新型コロナワクチンのmRNAと同じ配列のmRNAを、ウリジン、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジンを使用して合成し、タンパク質の産生量を比較した実験です。ミスマッチがあるかどうかも調べています。
In addition to comparable yields, we also noted that regardless of the modification status of the mRNA, the resultant spike protein appeared to be processed into smaller products in the HEK 293 cells (Figure 4B), as has been previously noted (Ou et al., 2020).
HEK293細胞でタンパク合成をすると、本来は250kDaのサイズのスパイクができるはずですが、100kDaの短いものに、「processed」されるようです。
タイトルが、faithful protein products が産生されるとなっていますが、どうなのでしょうか。
ミスマッチの部分ですが、逆転写するとミスマッチが起こるということがわかりました。M-MLV (Promega) と AMV (Promega) enzymes の2種類の逆転写酵素を使っているのですが、シュードウリジンだと両方でミスマッチが起こり、N1-メチルシュードウリジンだとM-MLVを使ったときだけミスマッチが起こったということです。ミスマッチは、修飾ウリジンがAあるいはGと間違えられています。シュードウリジンと比べると、N1-メチルシュードウリジンでのミスマッチは一桁少なくなっています。
この結果は、前回のブログの、ケト型とエノール型で、シュードウリジンは2つのケトン基がOH基になるエノール型で安定になり、N1-メチルシュードウリジンではメチル基がある分、１つのケトン基だけがエノール型になるという考察を支持しているのかもしれません。
mRNAの品質検査法を開発している論文で、ｍRNAをcDNAに転写せずに直接ナノポアシークエンスする実験結果がありました。
ナノポアシークエンスでは、分子の電荷分布を測定し、経験的にどの核酸なのかを決定しているようです。
実験結果から、N1-メチルシュードウリジンで修飾すると、U（赤）がC（青）と間違えられていることがわかりましたが、グラフをよく見ると、実は、UがA（緑）と間違えられている箇所があることがわかります。
Aは、終止コドンUAA、UAG、UGAのすべてに含まれています。
修飾mRNAをタンパク質に翻訳する際、tRNAがmRNAのUをAと混同してしまったらどうなるでしょうか。
終止コドンUAA、UAG、UGAのAがUに変更された、UUU、UUG、UGUの３つのコドンが、終止コドンとしてふるまえることになります。
コドン表をみると、UUU→Phe/F、UUG→Leu/L、UGU→Cys/Cとなっていますので、mRNAがこれらのコドンを使用していると、そこで翻訳が終止され、切断型タンパク質となってしまいます。
前回のブログで紹介した論文で、N1-メチルシュードウリジン修飾mRNAから、20kDa付近と40kDa付近にタンパク質が観察されている結果がありました。
5-メチルシチジンとN1-メチルシュードウリジンの両方で修飾したmRNAでは、目的物よりも40kDa付近のタンパク質の方が多くなっています。このタンパク質は、5-メチルシチジンだけの修飾mRNAでは生成されないので、N1-メチルシュードウリジンとより強く関連していることが示唆されます。
シュードウリジンの塩基のピリミジンは、下記のように2つの構造の間を変換することが比較的容易です。
ウリジンでは、窒素の一つにリボース（糖）が結合しているので、ケト体が安定している可能性がありますが、シュードウリジンでは、リボースが炭素に結合しているのでより安定なエノール体が多く存在していると考えられます。N1-メチルシュードウリジンの場合は、Nの一つにメチル基があるので、ケトンのひとつだけがエノールとなっていると思われます。
N1-メチルシュードウリジンmRNAのナノポアシークエンスで、UがCに間違えられている結果は、この考察を支持しています。
次に、UがAに間違えられるのはどうしてかを考察してみます。
それぞれの核酸を、電気的に見てみると、上から下に
Gは、マイナス、プラス、プラス
Cは、プラス、マイナス、マイナス
Aは、プラス、マイナス、
Uは、マイナス、プラス、マイナス
となっていて、GとC、AとUがそれぞれ電気的に引き付けられるようにして、水素結合を形成しています。この場合、Uの3番目のマイナスは結合に使用されません。
シュードウリジンは、ケト体の場合は、ウリジンと同じですが、
上のケトン（C＝O）がエノール体になると、プラス、マイナス、マイナスとなり、Gと水素結合を形成できることになります。
同時に、最初の２つのプラス、マイナスだけを使って、Aとしてふるまうことが可能なのかもしれません。
あるいは、もうすこし踏み込んで、分子軌道を考慮するともっと端的に説明できるかもしれません。
In contrast to an mRNA without any modification (a), the presence of a modification can result in aberrant translation termination, resulting in a protein pool with truncated peptides as observed for N1-m-pseudouridine (b).
「修飾の無いmRNAとは対照的に、修飾があると翻訳が途中で終止され、N1-メチルシュードウリジンで観察されたように切断型ペプチドのタンパク集団が作られうる。」
この記述の参照文献は、以下になります。
Interestingly, the translation of 5 mC/Ψ, 5 mC/N1mΨ and N1mΨ–Luc mRNAs yielded more nascent polypeptides or premature terminated products in both Krebs extract and RRL as compared to the unmodified mRNA (e.g. ∼20 kDa polypeptide (p20); Figure Figure33 and Supplementary Figure S4A). In addition, the 5 mC/N1mΨ–Luc mRNA produced a truncated protein of ∼40 kDa (p40). Although detectable for 5 mC/Ψ and N1mΨ Luc mRNAs as well, this product was much less abundant for the latter mRNAs. The formation of shortened luc polypeptides strongly suggests that ribosome movement is slowed down at the precise sites of modified mRNAs (32).
下の図で、Unmodが修飾なし、N1mΨがN1-メチルシュードウリジンで、15分後に、N1-メチルシュードウリジンmRNAでは20kDa付近と40kDa付近に、目的物よりも短い長さのタンパク質が作られていることがわかります。
N1-メチルシュードウリジンを含有するmRNAの翻訳が、一部、途中で終わってしまうことがわかりました。
終止コドンはUAA、UAG、UGAの3種なので、N1-メチルシュードウリジンがシチジンと間違われて終止する危険はなさそうです。
となると、この論文にあるような
N1-メチルシュードウリジンが他の核酸とより強く結合することにより、安定な2次構造を作ってしまったことによる影響かもしれません。
mRNA vaccine quality analysis using RNA sequencing
『RNA配列決定による、mRNAワクチンの品質分析』
We performed RNA sequencing of mRNA vaccines that include N1-methylpseudouridine (see ‘Methods’). We prepared both short- and long-read sequencing libraries from the modified mRNA. These libraries had lower yields (~50%) than matched, native mRNA vaccines, suggesting the modified nucleosides reduced the efficiency of cDNA library preparation (Fig. S9d).
N1-メチルシュードウリジンを含むmRNAワクチンの配列決定を行った。修飾mRNAの、ショートリード配列ライブラリーとロングリード配列ライブラリーの両方を作成した。これらのライブラリーは、配列が同じ未修飾mRNAワクチンと比較すると、収率が低く（約50％）、修飾核酸がcDNAライブラリー作成効率を低下させていることが示唆される（図S9d）。
この実験結果は、N1-メチルシュードウリジンを使用したmRNAを、逆転写酵素を使ってcDNAに逆転写しPCRで増幅する工程の効率が、普通の修飾の無いmRNAと比較すると、半減していることを示しています。
修飾ウリジンの使用が影響を与える部分は、逆転写の過程ですが、
（１）逆転写酵素が修飾ウリジン含有mRNAと結合しにくい
（２）相補DNAのアデノシンが修飾ウリジンと会合しにくい
のどちらかが原因だと思います。
（１）酵素の活性サイトに結合できるかどうかは、他の３つの核酸と比較して、修飾ウリジンでも分子のサイズや電荷分布のサイズに違いはさほどないので問題はないと思われます。
もしも、修飾ウリジンが、グアノシン（G）とも会合することになると、修飾ウリジンがアデノシンと会合する確率は半減します。
つまり、cDNAライブラリー作成の効率が半減しているのは、修飾ウリジンがCと間違えられてGに会合してしまうからなのではないかと思っています。
cDNAライブラリーのエラーはないということなので、ミスマッチを起こすほどには強く結合していないのかもしれません。
あるいは、mRNAの2次構造が安定過ぎて、逆転写の速度が遅くなっているだけかもしれませんが。
mRNAのシュードウリジン（Ψ ）が、翻訳過程でシチジン（C）間違えられるのかどうかを調べています。
新型コロナワクチンのmRNAのシュードウリジンはさらにメチル基に置換されたN1-メチルシュードウリジンですが、2011年のNatureの論文では、終止コドン（UAA）の最初のウリジンがシュードウリジンに置換されていると、Cに間違えられて、翻訳が終止されずに、下流にコードされているタンパク質が産生されることをそのタンパク質に結合する抗体で証明しています。
下の図の左がN1-メチルシュードウリジンで、右側がシュードウリジンです。
つまり、シュードウリジンがシチジンと間違えられて、グアノシン（G）が水素結合するということのようです。
シュードウリジンの２つある＝Oの間にあるNHの水素が、＝Oに移動してOHとなり、OHの結合したCとNが二重結合になるという感じです。
（右側にあるグアノシンと3つの水素結合を形成）
同様の事は、N1-メチルシュードウリジンでも可能だと思います。
ミトコンドリアのtRNAでも、タウリンが結合したウリジンが、コドンのGを認識することも論文で発表されていました。
こちらの論文では、N1-メチルシュードウリジンが翻訳を途中で終始させ、短い切断タンパクを生成するという悪影響について考察しています。
不思議なことに、この論文の本文には、N1-メチルシュードウリジンが翻訳を中止させることについて、またその参照した論文についての言及が全くなく、N1-メチルシュードウリジンが翻訳の効率を高めるという話とその参照論文が多数引用されていました。mRNAワクチンのための検閲が入っているように感じます。
以上のように、N1-メチルシュードウリジンで置換したmRNAにはまだまだ課題が山積しています。
キッシンジャー
ジョン・ケリー
ロスチャイルド
ロックフェラー
トランプ大統領
ビル・クリントン
Bands, Doug のエントリーで記入されている
ノースダコタ州のレイ・ホルムベルグ元共和党上院議員が
2023年10月30日、未成年との性交の罪で逮捕された
Arrested and arraigned on October 30, Holmberg pled not-guilty at the US District Court in Fargo, North Dakota.[22] Judge Alice Senechal released Holmberg under the conditions: forfeiture of his passport; no contact with minors, victims, and witnesses; no access to the internet, no travel outside Greater Grand Forks[7] or Fargo; and no possession of firearms.[23] Senechal set a trial date of December 5, 2023,[7] to be adjudicated by Judge Daniel L. Hovland. If convicted for child sex tourism, Holmberg could be sentenced to a maximum of 30 years imprisonment and $250,000 in fines; if convicted on the child pornography charge, Holmberg will receive a sentence between 5–20 years.[23]
同じくノースダコタ州の検事総長は、2022年1月に自殺している。同様の犯罪が疑われている。
核酸の相互作用は以下のようになっています。
タウリン修飾ウリジンは
N1-メチルシュードウリジンは、
N1-メチルシュードウリジンはシチジン（C）のようにふるまえるかは、二つの環状Nの間に挟まれたC＝Oの酸素がOHとなりに、NHの水素が取れて、CとNの間が二重結合になればいいということです。
不可能ではなさそうですが、もう少し調べてみないと何とも言えません。
ナノポアシークエンスでは、電流の流れに与える影響の違いを見ているようですが、電気的には、N1-メチルシュードウリジンはシチジン（C）よりもチミジン（T）に似ているように思われます。
前回の論文で、緑色蛍光タンパク質のmRNAをインビトロで転写をしたときのmRNAの品質管理にナノポアシークエンスを使用した時、 N1-メチルシュードウリジンだと上手くいかないという議論をしていました。
この結果について、レビュアーの1人が、
これは、配列決定が不正確なのか、あるいはT7転写におけるエラー率なのかと疑問を呈しています。
つまり、N1-メチルシュードウリジンを使うと、転写がうまくできなくなるのではないかという疑問です。
荒川先生のNoteでは、ウリジンをN1-メチルシュードウリジンに置換すると相補鎖への粘着度が上がることの説明がありました。
転写では、DNAとRNAが相補鎖を作って解離するを繰り返しているわけですから、N1-メチルシュードウリジンにすると解離するためのエネルギーが多く必要になります。生成されるmRNAに不具合がでることは容易に予想できます。
論文の著者は、電気泳動の結果では、修飾なしのウリジンとの違いがないので転写は問題なく行われていると仮定しています。
もう一度、電気泳動の結果を精査してみますと、下の修飾ウリジンのピークの方が、幅が広くなっていることがわかり、試料が不均一、つまり、基準のmRNAよりも分子量が大きいものと小さいものが混入していることが疑われます。また、ピークの位置も、分子量が小さい方へ若干シフトしていますし、前回述べた右側の肩も観察できます。
ただし、ナノポアシークエンスに見られた断片はピークとして観察されていませんが、この断片が、大きなmRNAに粘着して、右側の肩として観察されている可能性はあります。
転写時の問題なのか、分析時の問題なのか、あるいは両方に影響を与えているのかははっきりしませんが、N1-メチルシュードウリジンがシチジン（C）と間違えられていることははっきりしています。
そういえば、以前紹介した、核酸の冗長性の話でも、ウラシルがシトシンとみなされる修飾はありました。
これと同様のことが起こっていると、N1-メチルシュードウリジンのmRNAのタンパク質への翻訳は、実際問題、めちゃくちゃなタンパクを作ることになります。
幸運なことに5’端キャップ構造も分解しているようなので、まず、タンパク質に翻訳されることはないと思いますが。
コネチカット州ブリッジポート市の市長選挙で、現職の市長の支持者が多数の不在投票用紙を投票箱に投函している様子が監視カメラに捉えられていたため、この選挙のやり直しが命じられたということです。
同じことは、2020年の大統領選挙でもあったけれど、あの時、司法長官のビル・バーが、「結果に影響するほどの不正はなかった」と判断して、やり直しは命じられなかった。一体何を基準にそう判断したのだろう。
ところで、日本では未だにマスクをして秋の園遊会をやっているけれど、あのマスクは何を意味するのだろうか。
中国はきっと、大量のブラックメールカードを持っていて、日本に対してはやりたい放題なのかもしれない。
前回と同じ論文、緑色蛍光タンパク質のmRNAをモデルとして、インビトロで転写をしたときのmRNAの品質管理方法を提案する目的の論文ですが、ウラシルとN1-メチルシュードウリジンを使用して転写した時のmRNAの品質を検査できるか比較しています。
直接RNA配列決定法では、N1-メチルシュードウリジンをスキップしてしまう可能性があり、ピークの長さが実際よりも短く検出されるのではと議論していますが、それだけではなく、以下の図のCに示されるように、赤がN1-メチルシュードウリジン、青がウリジンを使用した場合ですが、短い断片が大量に検出されており、検出が途中で中断されているようです。また、メインのピークも、左側に小さなピークができていて、転写されたmRNAの品質の悪さが示されています。
5’端も、図bに示すN1-メチルシュードウリジン使用の場合には、図aに比較して、分解が更に進んでいる可能性があります。
mRNAというのは、転写されてから、キャップ構造とポリＡテールがタンパク質に結合して環状構造をとることにより安定化するようですが、この実験が示すように、インビトロ転写でできたmRNAに5’端がなくなっていると、翻訳されることはないと思います。
5’端が短くなっているのは、キャップ構造が付かなかったからで、5’端から分解されているのではないかと疑っています。
mRNAの合成のためのインビトロトランスクリプションの実用化には、まだまだ問題が山積のようです。
このキャップ化試薬を提供している会社のビデオがみれるのですが、90％以上のmRNAがキャップ化できると豪語していました。
たとえキャップ化ができたとしても、翻訳されるには、さらに、翻訳開始ファクターがキャップに結合しなくてはならないので、インビボでmRNAからタンパク質を合成するというmRNAのワクチンの実現はまだまだ遠いように思いました。
おまけですが、ケビン先生の実験を荒川先生が解説しているもので、プラスミドDNAのピークの右にさらに大きなサイズのDNAが検出されていましたが、
この論文でも、N1-メチルシュードウリジンにすると、RNAで右に肩が見えていました。
未修飾ウラシル
N1-メチルシュードウリジン
電気泳動の実験でも、分子量の大きい側に不純物がいろいろと含まれていることがわかります。mRNAの断片が、完全長のmRNAにハイブリダイズしているものでしょうか。
直接RNA配列決定法
N1-メチルシュードウリジンの検出がうまくいかないことの原因として、ナノポアタンパク質と、N1-メチルシュードウリジンが相互作用してしまうのかもしれません。