『これは、ハシカのようなもので、人間の持って生れた心の毒を、いちどは外へ吹き出さなければならねえものらしい。』
初出は「新潮」［1946（昭和21）年］ 。
海自ヘリの衝突事故に、中国の潜水艦が関与していたのではというインサイダー情報を話している中国系ユーチューブチャンネルがある。
この潜水艦の武官が、この事故の後、メダルを授与されている。
戦争をしたい集団が、何かを仕掛けているんじゃないのか。
細胞外から導入した、ファクターが結合していないmRNAが本当に翻訳されるのかという1つめの疑問、細菌に作らさせたmRNAには翻訳されたタンパクが既に結合しているのではないかという2つめの疑問に追加して、３つめの疑問は、もし翻訳されてヒトの細胞で目的タンパク質が作られたとしても、そのタンパク質にはヒトの糖鎖が結合しているので、ヒトの免疫系では免疫原性が示されないのではないかとうことです。
糖鎖については、このブログでは随分前から記事を書いていますが、免疫系が認識するのは糖タンパク質の糖が結合している部分ではないかという様々な傍証を提示してきました。
これについても、いつかまとめてみたいと思っています。
以前、mRNAを細胞外から導入しても、翻訳されないのではないかという考察をしました。
DNAからｍRNAに転写される際に、ｍRNAに結合するさまざまなファクターが、細胞外から導入した場合にはｍRNAに結合していないので、ｍRNAがリボソームに結合できないのではという疑問です。
今回は、ｍRNAが翻訳されている証拠として提示されているルシフェラーゼが、翻訳されなくても光るのではないかという疑問を提示しようと思います。
ワクチンに使用されるmRNAは、大腸菌に作らせています。大腸菌などの原核細胞では、DNAからｍRNAが転写される際に、転写と同時に翻訳が開始されます。つまり、ワクチン用に作られたmRNAにはすでにルシフェラーゼタンパクがくっついてしまっているわけです。
ルシフェラーゼのmRNAを含むワクチンを注射するということは、ルシフェラーゼタンパクそのものを注射していることになります。
マウスの実験で、mRNAが翻訳されるのかを確かめるために、ルシフェラーゼのmRNAを含むワクチンを注射した後、一定時間後にルシフェリンを注射して、ルシフェラーゼがルシフェリンを酸化することで発光させています。
ルシフェラーゼのmRNAには不純物として、ルシフェラーゼタンパクそのものが含まれているので、実際にmRNAが翻訳されたのか、不純物のタンパクが存在するのでルシフェリンが酸化されて発光したのか、見分けがつきません。
同様に、スパイクタンパクのmRNAを大腸菌で作らせる限り、スパイクタンパクそのものが不純物として含まれる可能性は否定できません。むしろ、原核細胞のｍRNA翻訳の機構を勉強すれば、タンパクが含まれると考える方が理論にかなっています。
上記の考察を、いつか時間があるときに図とともに説明したいと思っています。
ロシアのオリガルヒや中国の太子党がそれぞれの国から持ち出した莫大な違法資金の資金洗浄、南米の麻薬売買による利益の資金洗浄、アフリカや中東の人身売買による利益の資金洗浄
デジタル通貨によりお金の流れが明らかになると困る人たち
自動車産業や電子機器産業による地下水くみ上げによる地盤沈下、地震、シンクホール
英国のキャサリン妃が自殺したのではないかという噂、キャサリン妃が治療を終えて公の場に姿を見せる予定の日程がどんどん先延ばしになっている、ウイリアムの愛人の噂
マイナンバー制度で困るのは、違法移民のための偽造保険証や不正な社会保障受け取りを斡旋している団体
世界経済フォーラムやWHOの提案が極端すぎて、わかりやすすぎるのが気になる
本当にやりたいなら、気が付かれないようにこっそりやるんじゃないか
表で騒がさせて、何かを隠そうとしているようにみえる
レプリコンワクチンのmRNAには、ベネズエラ馬脳炎ウイルスのRNAレプリカーゼをコードする配列が組み込まれている
RNAレプリカーゼとは、RNA依存性RNAポリメラーゼ (RdRP)という酵素であり、RNAをテンプレートにRNAを複製するということになっている
酵素とは、タンパク質でできた触媒であり、タンパク質には、1次構造（線）、2次構造（面）、3次構造（立体）があって、この3次構造は、主にアミノ酸の間の水素結合によって決められている
つまり、アミノ酸が置換してしまったら、この水素結合の位置や強さが変わってしまい、タンパク質の立体構造が変化してしまうことになる
触媒である酵素は、その立体構造で触媒活性を支えている
アミノ酸が一つ置換しただけで、酵素が働かなくなって病気になる例は良く知られている
DNAの場合には、複製中におこったエラーを修正するタンパク質が存在するが、RNAの場合にはそれがない
つまり、「RNAウイルスは変異する」
レプリコンワクチンに使用されるレプリカーゼは、RNAウイルス由来である
つまり、変異しやすい遺伝子であり、酵素は変異したら使い物にならない
レプリコンワクチンは極めて怪しい概念である
この白い物体について
ゴム状だという話
おそらく、mRNAのアジュバントの役割をしているカチオン性脂質ナノ粒子により産生された抗体の硫黄が、ゴムにおける硫黄の役割を果たしているのではないか
抗体の構造
赤いSが硫黄
多数の抗体が多数の糖タンパクの糖鎖に結合して、高分子を形成している
抗体の中にある硫黄結合が、ゴム状の性質を与えている
プリオンタンパクに言及しているグループがあるが、実際にプリオン病で亡くなった人たちの死因となっている話は聞いたことがない
スパイクタンパクに言及しているグループもあるが、スパイクタンパクがｍRNAワクチン由来なのか、もともと生物がもっているものなのかの話も決着がついていない（PCRはコロナと無関係な様々なサンプルで陽性になっている）
ワクチンのｍRNAが翻訳されるのかの疑問もある
ワクチンのｍRNAの修飾ウリジンが他の核酸に間違えられる問題もある
2018年の論文で、核酸の修飾が、転写に与える影響を調べています。
修飾核酸は、以下の図にある5種類で、新型コロナワクチンで使用されたN1-メチルシュードウリジンはありませんが、シュードウリジンに関して興味深い結果が得られています。
実験は、適当な配列のDNAをテンプレートとしてT7ベクターを作って、これを、T7RNAポリメラーゼでmRNAに転写し、この時、修飾核酸を使用して、mRNAに修飾核酸を取り入れています。
できたｍRNAを、種々の逆転写酵素で逆転写してcDNAを生成、このcDNAをもう一度転写して、dsDNAを生成し、このdsDNAのエラーを調べています。
エラーは、T7RNAポリメラーゼによるｍRNAをへの転写反応で起こるものと、
mRNAからcDNAへの逆転写で起こるものと、
cDNAからdsDNAを合成するときにおこるものの3種類があります。
例えばシュードウリジンの場合、
rA→rU/dT→dAというエラーが、未修飾のmRNAに比較して12倍となっています。
この実験では、cDNAのエラーをみているので、T7ポリメラーゼのエラーか逆転写のエラーかの区別はすぐにはつきませんので、rA→rU/dT→dAと示しています。
このエラーのrA→rUは、テンプレートのAから作ったｍRNAのAがUに間違って転写されたということで、テンプレートの2本鎖DNAのマイナス鎖のTにU（シュードウリジン）が誤って会合してしまったということです。
dT→dAは、ｍRNAのAを逆転写するさいに、TではなくAに逆転写されたことを示しています。つまり、ｍRNAのAに、アデノシン（A）が会合してしまったということです。
実際には、この２つの可能性のひとつが起こっており、それは、エラーのパターンから判断し、シュードウリジンの場合は、T7RNAポリメラーゼによる転写反応でのエラーであることがわかりました。
これは、シュードウリジンの場合ですが、前回のブログで、N1-メチルシュードウリジンのエラーがシュードウリジンよりも一桁低い結果がでていましたが、DNAからRNAへの転写反応でのエラーは、産生されるタンパク質に多大な影響を及ぼすので、注視する必要があります。
特に、他の論文で、N1-メチルシュードウリジンが切断型の短いタンパク質を産生したという実験結果がありましたので、このエラーによって終止コドンが現れたのかどうかなどは考察するメリットがあると思いました。
新型コロナワクチンのmRNAと同じ配列のmRNAを、ウリジン、シュードウリジン、N1-メチルシュードウリジンを使用して合成し、タンパク質の産生量を比較した実験です。ミスマッチがあるかどうかも調べています。
In addition to comparable yields, we also noted that regardless of the modification status of the mRNA, the resultant spike protein appeared to be processed into smaller products in the HEK 293 cells (Figure 4B), as has been previously noted (Ou et al., 2020).
HEK293細胞でタンパク合成をすると、本来は250kDaのサイズのスパイクができるはずですが、100kDaの短いものに、「processed」されるようです。
タイトルが、faithful protein products が産生されるとなっていますが、どうなのでしょうか。
ミスマッチの部分ですが、逆転写するとミスマッチが起こるということがわかりました。M-MLV (Promega) と AMV (Promega) enzymes の2種類の逆転写酵素を使っているのですが、シュードウリジンだと両方でミスマッチが起こり、N1-メチルシュードウリジンだとM-MLVを使ったときだけミスマッチが起こったということです。ミスマッチは、修飾ウリジンがAあるいはGと間違えられています。シュードウリジンと比べると、N1-メチルシュードウリジンでのミスマッチは一桁少なくなっています。
この結果は、前回のブログの、ケト型とエノール型で、シュードウリジンは2つのケトン基がOH基になるエノール型で安定になり、N1-メチルシュードウリジンではメチル基がある分、１つのケトン基だけがエノール型になるという考察を支持しているのかもしれません。
mRNAの品質検査法を開発している論文で、ｍRNAをcDNAに転写せずに直接ナノポアシークエンスする実験結果がありました。
ナノポアシークエンスでは、分子の電荷分布を測定し、経験的にどの核酸なのかを決定しているようです。
実験結果から、N1-メチルシュードウリジンで修飾すると、U（赤）がC（青）と間違えられていることがわかりましたが、グラフをよく見ると、実は、UがA（緑）と間違えられている箇所があることがわかります。
Aは、終止コドンUAA、UAG、UGAのすべてに含まれています。
修飾mRNAをタンパク質に翻訳する際、tRNAがmRNAのUをAと混同してしまったらどうなるでしょうか。
終止コドンUAA、UAG、UGAのAがUに変更された、UUU、UUG、UGUの３つのコドンが、終止コドンとしてふるまえることになります。
コドン表をみると、UUU→Phe/F、UUG→Leu/L、UGU→Cys/Cとなっていますので、mRNAがこれらのコドンを使用していると、そこで翻訳が終止され、切断型タンパク質となってしまいます。
前回のブログで紹介した論文で、N1-メチルシュードウリジン修飾mRNAから、20kDa付近と40kDa付近にタンパク質が観察されている結果がありました。
5-メチルシチジンとN1-メチルシュードウリジンの両方で修飾したmRNAでは、目的物よりも40kDa付近のタンパク質の方が多くなっています。このタンパク質は、5-メチルシチジンだけの修飾mRNAでは生成されないので、N1-メチルシュードウリジンとより強く関連していることが示唆されます。
シュードウリジンの塩基のピリミジンは、下記のように2つの構造の間を変換することが比較的容易です。
ウリジンでは、窒素の一つにリボース（糖）が結合しているので、ケト体が安定している可能性がありますが、シュードウリジンでは、リボースが炭素に結合しているのでより安定なエノール体が多く存在していると考えられます。N1-メチルシュードウリジンの場合は、Nの一つにメチル基があるので、ケトンのひとつだけがエノールとなっていると思われます。
N1-メチルシュードウリジンmRNAのナノポアシークエンスで、UがCに間違えられている結果は、この考察を支持しています。
次に、UがAに間違えられるのはどうしてかを考察してみます。
それぞれの核酸を、電気的に見てみると、上から下に
Gは、マイナス、プラス、プラス
Cは、プラス、マイナス、マイナス
Aは、プラス、マイナス、
Uは、マイナス、プラス、マイナス
となっていて、GとC、AとUがそれぞれ電気的に引き付けられるようにして、水素結合を形成しています。この場合、Uの3番目のマイナスは結合に使用されません。
シュードウリジンは、ケト体の場合は、ウリジンと同じですが、
上のケトン（C＝O）がエノール体になると、プラス、マイナス、マイナスとなり、Gと水素結合を形成できることになります。
同時に、最初の２つのプラス、マイナスだけを使って、Aとしてふるまうことが可能なのかもしれません。
あるいは、もうすこし踏み込んで、分子軌道を考慮するともっと端的に説明できるかもしれません。
In contrast to an mRNA without any modification (a), the presence of a modification can result in aberrant translation termination, resulting in a protein pool with truncated peptides as observed for N1-m-pseudouridine (b).
「修飾の無いmRNAとは対照的に、修飾があると翻訳が途中で終止され、N1-メチルシュードウリジンで観察されたように切断型ペプチドのタンパク集団が作られうる。」
この記述の参照文献は、以下になります。
Interestingly, the translation of 5 mC/Ψ, 5 mC/N1mΨ and N1mΨ–Luc mRNAs yielded more nascent polypeptides or premature terminated products in both Krebs extract and RRL as compared to the unmodified mRNA (e.g. ∼20 kDa polypeptide (p20); Figure Figure33 and Supplementary Figure S4A). In addition, the 5 mC/N1mΨ–Luc mRNA produced a truncated protein of ∼40 kDa (p40). Although detectable for 5 mC/Ψ and N1mΨ Luc mRNAs as well, this product was much less abundant for the latter mRNAs. The formation of shortened luc polypeptides strongly suggests that ribosome movement is slowed down at the precise sites of modified mRNAs (32).
下の図で、Unmodが修飾なし、N1mΨがN1-メチルシュードウリジンで、15分後に、N1-メチルシュードウリジンmRNAでは20kDa付近と40kDa付近に、目的物よりも短い長さのタンパク質が作られていることがわかります。
N1-メチルシュードウリジンを含有するmRNAの翻訳が、一部、途中で終わってしまうことがわかりました。
終止コドンはUAA、UAG、UGAの3種なので、N1-メチルシュードウリジンがシチジンと間違われて終止する危険はなさそうです。
となると、この論文にあるような
N1-メチルシュードウリジンが他の核酸とより強く結合することにより、安定な2次構造を作ってしまったことによる影響かもしれません。
mRNA vaccine quality analysis using RNA sequencing
『RNA配列決定による、mRNAワクチンの品質分析』
We performed RNA sequencing of mRNA vaccines that include N1-methylpseudouridine (see ‘Methods’). We prepared both short- and long-read sequencing libraries from the modified mRNA. These libraries had lower yields (~50%) than matched, native mRNA vaccines, suggesting the modified nucleosides reduced the efficiency of cDNA library preparation (Fig. S9d).
N1-メチルシュードウリジンを含むmRNAワクチンの配列決定を行った。修飾mRNAの、ショートリード配列ライブラリーとロングリード配列ライブラリーの両方を作成した。これらのライブラリーは、配列が同じ未修飾mRNAワクチンと比較すると、収率が低く（約50％）、修飾核酸がcDNAライブラリー作成効率を低下させていることが示唆される（図S9d）。
この実験結果は、N1-メチルシュードウリジンを使用したmRNAを、逆転写酵素を使ってcDNAに逆転写しPCRで増幅する工程の効率が、普通の修飾の無いmRNAと比較すると、半減していることを示しています。
修飾ウリジンの使用が影響を与える部分は、逆転写の過程ですが、
（１）逆転写酵素が修飾ウリジン含有mRNAと結合しにくい
（２）相補DNAのアデノシンが修飾ウリジンと会合しにくい
のどちらかが原因だと思います。
（１）酵素の活性サイトに結合できるかどうかは、他の３つの核酸と比較して、修飾ウリジンでも分子のサイズや電荷分布のサイズに違いはさほどないので問題はないと思われます。
もしも、修飾ウリジンが、グアノシン（G）とも会合することになると、修飾ウリジンがアデノシンと会合する確率は半減します。
つまり、cDNAライブラリー作成の効率が半減しているのは、修飾ウリジンがCと間違えられてGに会合してしまうからなのではないかと思っています。
cDNAライブラリーのエラーはないということなので、ミスマッチを起こすほどには強く結合していないのかもしれません。
あるいは、mRNAの2次構造が安定過ぎて、逆転写の速度が遅くなっているだけかもしれませんが。
mRNAのシュードウリジン（Ψ ）が、翻訳過程でシチジン（C）間違えられるのかどうかを調べています。
新型コロナワクチンのmRNAのシュードウリジンはさらにメチル基に置換されたN1-メチルシュードウリジンですが、2011年のNatureの論文では、終止コドン（UAA）の最初のウリジンがシュードウリジンに置換されていると、Cに間違えられて、翻訳が終止されずに、下流にコードされているタンパク質が産生されることをそのタンパク質に結合する抗体で証明しています。
下の図の左がN1-メチルシュードウリジンで、右側がシュードウリジンです。
つまり、シュードウリジンがシチジンと間違えられて、グアノシン（G）が水素結合するということのようです。
シュードウリジンの２つある＝Oの間にあるNHの水素が、＝Oに移動してOHとなり、OHの結合したCとNが二重結合になるという感じです。
（右側にあるグアノシンと3つの水素結合を形成）
同様の事は、N1-メチルシュードウリジンでも可能だと思います。
ミトコンドリアのtRNAでも、タウリンが結合したウリジンが、コドンのGを認識することも論文で発表されていました。
こちらの論文では、N1-メチルシュードウリジンが翻訳を途中で終始させ、短い切断タンパクを生成するという悪影響について考察しています。
不思議なことに、この論文の本文には、N1-メチルシュードウリジンが翻訳を中止させることについて、またその参照した論文についての言及が全くなく、N1-メチルシュードウリジンが翻訳の効率を高めるという話とその参照論文が多数引用されていました。mRNAワクチンのための検閲が入っているように感じます。
以上のように、N1-メチルシュードウリジンで置換したmRNAにはまだまだ課題が山積しています。