2020年4月24日投稿
トルコの研究所や大学
『SARS-CoV-2 Isolation and Propagation from Turkish COVID-19 patients』
タイトル「COVID-19トルコ人患者からのSARS-CoV-2の単離と増殖」
方法
１．検体の採取と輸送
イスタンブールのアシバデムアルトゥニザデ病院でのリアルタイムPCR分析によりCOVID-19陽性と診断された患者の鼻咽頭腔および口腔咽頭腔からサンプルを採取した．スワブを輸送培地に入れ、分析と増殖のために同日に4℃でAcibadem Labcell Cellular Therapy Laboratory BSL-3ユニットに移送した．トランスファー培地は、DMEM高グルコース（Thermo Fisher Scientific、米国）、2％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（Biological Industries、イスラエル）、および5 µg / mLアンホテリシン（Bristol Myers Squibb、米国）を含有する．
２．ウイルス増殖
ウイルス価が低いため、Vero細胞株（CCl-81、ATCC）を含む96ウェルプレートで増殖プロセスを開始した．最初に、Vero細胞をトリプシン処理、遠心分離して、2％ウシ胎児血清と1％ペニシリン-ストレプトマイシン-アンフォテリシンを含むDMEM高グルコースからなるウイルス培地に懸濁した．細胞を各ウェルに2.5×104個播種した。次に、100 µlのウイルスサンプルを最初のラインに加え、50 µlのウイルス培地をプレートの他のウェルに加えました。 50μlのウイルス溶液で第1ラインから第12ラインまで段階希釈を行い、37℃でインキュベートした．毎日、細胞変性効果を倒立顕微鏡で観察した．細胞をウェルから掻き取り、ウェル当たり25×104濃度のVero細胞株を含む24ウェルプレートに移した. 細胞変性効果が観察され、細胞はT75組織培養フラスコに移した．ウイルス培養物を加える前に、Vero細胞を5×106濃度でT75組織培養フラスコに添加し、ウイルス培養物は単層細胞に移した．この時点で、細胞変性効果の平均日数は3〜4日と報告されている．さらに増殖させるために、ウイルス培養物をT300組織培養フラスコに移した。
3. ウイルス単離
感染した細胞は、毎日観察し、SARS-CoV-2を確認するため以下の分析を行った．
リアルタイムPCR
全RNAの分離は、Direct-zol RNA Miniprep Kitを使用して行い、濃度は、Qubit RNA HSアッセイ付きQubit蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific、米国）を使用して決定した． ランダムオリゴヌクレオチドを使用してcDNA合成を行った． SARS-CoV-2 LAMPプライマーミックスと内部コントロールLAMPプライマーミックスを使用して、CFX-96で2つのLAMPアッセイ反応をサンプルごとに設定した． EvaGreen蛍光色素（Biotium、USA）を各反応混合物に加えて、リアルタイムLAMP検出を行った．結果の評価には、メルトカーブ分析と％2アガロースゲル電気泳動を使用した． ここでは、ウイルスN遺伝子をSARS-CoV-2の標的遺伝子として使用し、内部コントロールとしてアクチンを使用した．
透過型電子顕微鏡
（省略）
プラークアッセイ
Plaque test was performed based on general procedure with small modifications as following. Vero cells were seeded for 6-well plate (1×105cells/well) and leaved for 24 h incubation at 37°C. After cell incubation period, virus titration was prepared in Log10 serial dilutions. Cells were washed with cell media (DMEM High, Thermo Fisher Scientific, USA) that contain only 1% PSA (Pan Biotech Germany). Virus titrations were inoculated to cells in 1 ml volume, leaved for the 1-hour incubation, and plates were shaken gently in 20 minutes. In this period also plaque medium that contains 2% agarose and media (2% FBS and 1% PSA) in 1:1 volume ratio were prepared and put into the 56°C water bath for 30 minutes. After virus inoculation, excess viruses were removed and 1 ml plaque medium added on infected cells. The plaque medium should warm avoid the damage of the cell monolayer. Plates were left under the hood for 15 minutes without a cap and then put into 37 °C incubator for 7-10 days. For the counting of the plaque firstly cells were fixated with 10% of paraformaldehyde for 1 hour. Agarose layers were removed from the well and then 500 µl of crystal violet solution was added to each well and incubated on a shaker for 5-10 minutes. Crystal violet was discarded and plates were washed with tap water without disrupting cell monolayer until the water was clear. Plates were left on a paper towel till dry. Plaques were imaged under an inverted microscope.
この論文では、他の病原体の検査は全くしておらず、段階希釈して単離したウイルスが新型コロナウイルスであることをウイルスのＮ遺伝子のＬＡＭＰ法で確認している。
その結果が ↓
プラークアッセイもきちんと行っているけれど、他の文献では72時間でプラークが生成したのに、この論文は6日かかっている。
なので、違うウイルスを増殖した可能性は捨てきれないと素人ながらに思う。
前回までは、動物モデルを中心にウイルスが単離されているかどうかを調べましたが、今回以降は、国別に単離されているかどうかを調べてみます。
１．カナダ
3月13日にカナダの科学者チームがCovid-19大流行をおこした株を単離したと報じるインディペンデント紙のニュースです
チームの1人、Rob Kozakの名前で論文検索してみましたら、Covid-19を含む論文が3報見つかりました。
（１）Diagnosis and Management of First Case of COVID-19 in Canada: Lessons applied from SARS.
3月9日
タイトル「カナダの最初のCOVID-19の症例の診断と治療：SARSの経験を応用」
この論文にはウイルス分離などの記載はありませんでした。
（２）Real-time PCR-based SARS-CoV-2 detection in Canadian laboratories.
5月2日受理
タイトル「カナダの研究所におけるリアルタイムPCRによるSARS-CoV-2の検出」
この論文も、臨床現場におけるＰＣＲでの検出が流行を抑え込むことができる云々の話しのようで、ウイルス単離の記載はありませんでした。
（３）Isolation, Sequence, Infectivity, and Replication Kinetics of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2.
4月12日掲載
タイトル「SARS-CoV-2の単離、配列、感染性、および増殖」
後に論文が掲載されるのはCDCが発行しているEmerging Infectious Diseasesです
「要旨
2019年12月に中国の武漢で発生して以来、SARS-CoV-2は世界中で600万人に感染した。地球全体に広がる中、我々はこのウイルスが感染可能はヒトの細胞の種類を調査した。我々は、カナダのトロントの2人の患者からSARS-CoV-2を単離し、ゲノム配列を決定し、我々のウイルス系統の代表的な集団の一塩基変異を特定した。また我々はSARS-CoV-2が増殖感染するヒトの免疫細胞を調べた。SARS-CoV-2は、ヒト初代末梢血単核細胞に感染しないことを確認した。SARS-CoV-2が世界的に広がっている中で、ウイルスの一塩基多型をモニターすることは重要であり、循環ウイルスを分離し、in vitroおよびin vivoの感染モデルを使用してウイルスの遺伝子型と表現型を決定し続けることが重要である。 」
以下は、単離についての記載です
「Isolation and Quantification
We seeded Vero E6 cells at a concentration of 3 × 105 cells/well in a 6-well plate. The next day, we collected 200 μL of mid-turbinate swab samples from 2 COVID-19 patients, mixed it with 200 μL of DMEM containing 16 μg/mL TPCK-treated trypsin and inoculated the cells. After 1 h, the inoculum was replaced with DMEM containing 2% FBS and 6 μg/mL TPCK-treated trypsin. We observed the cells daily under a light microscope. Supernatant from the cells was used to determine virus titers (50% tissue culture infectious dose [TCID50]/mL) according to the Spearman and Karber method (6,7) as outlined previously (8).」
中鼻甲介スワブサンプルを、トリプシン処理した後、VeroE6細胞に播種して、細胞の変化を光学顕微鏡で観察、上澄みから公知の方法によりウイルス価を決定したということ。
臨床サンプルに含まれている他の病原体等の除去については記載なしでした。
ウイルスが増殖したのは、VeroE6細胞と、Calu-3細胞(human lung adenocarcinoma derived; ATCC) だけだったということ。増殖はなかったが、ＣＤ４＋細胞の中にウイルス粒子が観察されたということ。
以上、カナダで単離されたと報道された新型コロナウイルスの単離は、精製したものではないことがわかりました。
SARS-CoV-2/SB2-TYAGNC
SARS-CoV-2/SB3-TYAGNC
その９からの続きで、サイエンス誌の動物モデルの記事で参照した文献で使用したウイルスが単離されたものかどうか調べています。
９. Q. Gao et al., Science 10.1126/science.abc1932 (2020).
10. S. F. Sia et al., Research Square 10.21203/rs.3.rs-20774/v1 (2020).
11. V. D. Menachery et al., J. Virol. 94, (2020).
12. Y. Chen et al., J. Med. Virol. 10.1002/jmv.25825 (2020).
13. S. S. Lakdawala et al., Nature 526, 122 (2015).
14. Y. I. Kim et al., Cell Host Microbe 20, 30187 (2020).
15. N. Daly, “Seven more big cats test positive for coronavirus at Bronx Zoo,” National Geographic, 22 April 2020.
9. Q. Gao et al., Science 10.1126/science.abc1932 (2020).
Sinovac Biotech Ltd.
「Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2」
中国のワクチン会社による『SARS-CoV-2不活化ワクチンの開発』に関する論文
入院患者11人の気管支肺胞洗浄液から、ウイルスを単離したということ。
サンプルは、中国５、イタリア３、スイス１、英国１、スペイン１からのもの。
ワクチンの有効性を示すために、世界中のサンプルで試験している。
特にイタリアのウイルスが強毒性と考えられているため。
「To develop preclinical in vitro neutralization and challenge models for a candidate SARS-CoV-2 vaccine, we isolated SARS-CoV-2 strains from the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) samples of 11 hospitalized patients (including 5 patients in intensive care), among which 5 are from China, 3 from Italy, 1 from Switzerland, 1 from UK and 1 from Spain (table S1).
We chose strain CN2 for purified inactivated SARS-CoV-2 virus vaccine development (PiCoVacc) and another 10 strains (termed as CN1, CN3-CN5 and OS1-OS6) as preclinical challenge strains. Of note, the CN1 and OS1 strains are closely related to 2019-nCoV-BetaCoV /Wuhan/WIV04/2019 and EPI_ISL_412973, respectively, which have been reported to cause severe clinical symptoms, including respiratory failure, requiring mechanical ventilation (9, 10).」
サプリメント資料にウイルスは、浙江省ＣＤＣから提供されたということ。
その後、Vero細胞で大量培養。
「Vaccine candidate preparation
SARS-CoV-2 coronavirus, isolated from a COVID-19 infected patient, was provided by Zhejiang Provincial Center for Disease Control and Prevention. Viruses were cultured in large-scale Vero cells factories, and inactivated with β-propiolactone for 24 hours, followed by purification with Ion-exchange Chromatography (IEC) and Size Exclusion Chromatography (SEC) method. The purified viruses were mixed with Al(OH)3 adjuvant and served as SARS-CoV-2 vaccine candidate. 」
この論文で使用されたウイルス単離体は、浙江省CDCが単離したものなので、単離方法は、この論文中では不明でした。
１０．S. F. Sia et al., Research Square 10.21203/rs.3.rs-20774/v1
その６で紹介したハムスターの実験と同じく、香港大学の論文ですが、こちらは、公衆衛生学部や病理学部となっています。
タイトルは『ゴールデンシリアンハムスターにおけるSARS-CoV-2
ウイルスの病原性と感染性』
「Virus.
SARS-CoV–2 virus was isolated from the first confirmed COVID–19 patient in Hong Kong in Vera E6 cells at the BSL–3 core facility, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong. Stock virus at the titer of 107.25 TCID50/mL was prepared after three serial passages in Vero E6 cells in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) supplemented with 4.5 g/L D-glucose, 100 mg/L sodium pyruvate, 2% FBS, 100,000 U/L Penicillin- Streptomycin, and 25mM HEPES. 」
その６の香港大学の論文では、参考文献を辿っていくと、患者の唾液を検体として使用していることがわかりましたが、こちらの論文は参照文献の記載すらなく、単離されたことが既成事実とされているようです。
11. V. D. Menachery et al., J. Virol. 94, (2020).
テキサス大学
Trypsin Treatment Unlocks Barrier for Zoonotic Bat Coronavirus Infection
タイトル『トリプシン処理により、動物由来感染コウモリコロナウイルス感染のバリアを解き明かす』
トリプシンがあると、コウモリのコロナウイルスがヒトやサルの細胞に感染しやすくなるというパンデミックより数百倍興味深い論文
武漢大学病院
タイトル『COVID‐19患者の糞便にSARS‐CoV‐2のRNAを検出』
この論文は、糞便中のウイルスを検出しただけで単離はしていません。
この論文の参考文献17に、糞便からウイルスを単離したことが書いてるようなので、そちらを見てみます。
https://www.gastrojournal.org/article/S0016-5085(20)30282-1/pdf?referrer=https%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com%2F
孫逸仙大学
タイトル『SARS-CoV-2が消化器感染する証拠』
「Recently, we and others have isolated infectious SARS-CoV-2 from stool (unpublisheddata, 2020), confirming the release of the infectious virions to the gastrointestinal tract.」
この論文の実験では、ウイルス検出のみですが、未発表のデータで、感染性のあるウイルスウイルス粒子が消化管に放出されることを確認していると書いてありました。
13. S. S. Lakdawala et al., Nature 526, 122 (2015).
2015年の論文です。
14. Y. I. Kim et al., Cell Host Microbe 20, 30187 (2020).
https://www.cell.com/cell-host-microbe/pdf/S1931-3128(20)30187-6.pdf
その７で紹介した、韓国のフェレットの実験です。
使用したウイルスは、韓国第1号患者でしたが、単離の詳細を記載する文献はみつかりませんでした。
15. N. Daly, “Seven more big cats test positive for coronavirus at Bronx Zoo,” National Geographic, 22 April 2020.
これは、ナショナルジオグラフィック誌の記事で、ニューヨークのブロンクス動物園のネコ科の動物が陽性だったということです。
以上から、サイエンス誌で紹介されている動物モデルの論文で使用した単離ウイルスで、きちんと単離したことが証明されているものはありませんでした。
今のことろ、米国ＣＤＣのサイトに単離方法が書かれており、これが一番詳しいと思われます。中国ＣＤＣでも単離されていますが、英語での詳細は不明でした。
Science Vol. 368, Issue 6494, pp. 942-943
2020年5月29日付で、「サイエンス」誌に
タイトル『COVID-19動物モデルの探索』という記事が載っていました。
この記事に取り上げられている論文で使用された「ウイルス単離体」なるものについて精査していきたいと思います。
この記事の参考文献は以下の１５です。
- J. Shi et al., Science 368, 1016 (2020).
- B. Rockx et al., Science 368, 1012 (2020).
- Z. Wu, J. M. McGoogan, JAMA 323, 1239 (2020).
- L. M. Gretebeck et al, Curr. Opin. Virol. 13, 123 (2015).
- P. Zhou et al., Nature 579, 270 (2020).
- P. B. McCray Jr. et al., J. Virol. 81, 813 (2007).
- V. D. Menachery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113, 3048 (2016).
- L. Bao et al., bioRxiv 10.1101/2020.02.07.939389 (2020).
- Q. Gao et al., Science 10.1126/science.abc1932 (2020).
- S. F. Sia et al., Research Square 10.21203/rs.3.rs-20774/v1 (2020).
- V. D. Menachery et al., J. Virol. 94, (2020).
- Y. Chen et al., J. Med. Virol. 10.1002/jmv.25825 (2020).
- S. S. Lakdawala et al., Nature 526, 122 (2015).
- Y. I. Kim et al., Cell Host Microbe 20, 30187 (2020).
- N. Daly, “Seven more big cats test positive for coronavirus at Bronx Zoo,” National Geographic, 22 April 2020.
Science 29 May 2020:
Vol. 368, Issue 6494, pp. 1016-1020
Vol. 368, Issue 6494, pp. 1016-1020
中国ハルビンの獣医学研究所
タイトル『フェレット、ネコ、イヌ、他の家畜動物のSARS-CoV-2への感染性』
この実験で使用したウイルス株は以下の２つです。
「Two virus strains were used in this study: (i) SARS-CoV-2/F13/environment/2020/Wuhan (F13-E), isolated from an environmental sample collected in the Huanan Seafood Market in Wuhan, and (ii) SARS-CoV-2/CTan/human/2020/Wuhan (CTan-H), isolated from a human patient. 」
謝辞の部分
「Two strains of 2019 novel coronavirus (CTan-H and F13-E) were obtained from the China CDC under a material transfer agreement ・・・」
サプリメント資料の中に実験の詳細がありますが、ウイルスについては以下になります。
「Virus
SARS-CoV-2 strain BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019(C-Tan-HB01) (GISAID accession no. EPI_ISL_402119) [formally designated as SARS-CoV-2/CTan/human/2019/Wuhan (CTan-H) in this study] was isolated from a human patient (2) and SARS-CoV-2 strain BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-envF13-20/2020 (F13) (GISAID accession no.EPI_ISL_408514) [formally designated as SARS-CoV-2/F13/environment/2020/Wuhan(F13-E) in this study] was isolated from an environmental sample collected in Huanan seafood market, Wuhan. The two viruses differ in two nucleotides in their non-coding region:CTan-H bears 15C and 48C, whereas 3F13-E bears 15T and 48A. Viral stocks were prepared in Vero E6 cells with DMEM containing 2% FBS, 5 ug/ml TPCK-trypsin, and 30 mmol/L MgCl2. Viruses were harvested and the titers were determined by means of plaque assay inVero E6 cells.」
使用されたウイルスは、中国ＣＤＣから得たものということで、
BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019 は患者由来、
BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-envF13-20/2020 は武漢華南海鮮卸売市場由来のサンプルです。
BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019は、このシリーズのその１とその２で紹介した論文で使用されたもので、単離されているか疑わしいものでした。
BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-envF13-20/2020は、武漢華南海鮮卸売市場から1月1日に採取されたもので、患者のサンプルは変異０で、これと比較して変異が2つあると書いてあります。
このサンプルを使用して、系統樹の解析をしている論文がいくつかありますが、単離についての詳細なプロセスを開示している論文はみつかりませんでした。
２．B. Rockx et al., Science 368, 1012 (2020).
サイエンス誌の記事の参考文献２の論文は、オランダのエラスムス大学、タイトル『ヒト以外の霊長類モデルにおける、COVID-19, MERSおよびSARSの病理発生比較』で、臨床サンプルを数回継代培養したものでした。
『Characteristics of and Important Lessons From the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Outbreak in China』
この論文は、ウイルスの単離には関係ないものです。
４．L. M. Gretebeck et al, Curr. Opin. Virol. 13, 123 (2015).
これは、2002年のSARSとMERSについての論文です。
５．P. Zhou et al., Nature 579, 270 (2020).
これは初期の患者についてのNatureの2つ目の論文です。
（1つ目の論文は、Nature 579, 265–269 (2020) ）
６．と７．も古い論文
８．L. Bao et al., bioRxiv 10.1101/2020.02.07.939389 (2020)
これも、既にその６でみたもので、ヒト化したマウスでの病原性について、使用したウイルス単離体は、中国ＣＤＣで単離したというものでした。
続く
デビット・クロウ氏の「ヒトのRNAはすべてが配列決定されているわけではない」 という意見の補足です
ウイルスゲノムを決定するために使用した気管支肺胞洗浄液には、肺炎を起こしている患者からの検体である場合、ウイルスだけでなく、患者由来のマクロファージやＴ細胞などの免疫細胞が混ざっていると考えられます。
検体に含まれているＲＮＡは、配列決定の前にＤＮＡに逆転写されますが、検体には、マクロファージやＴ細胞などが持つＤＮＡやＲＮＡも含まれています。
マクロファージやＴ細胞のRNAは逆転写すると、もともとあったDNAの断片に逆転写されますが、Ｔ細胞の受容体の場合、DNAからRNAに転写される際に、以下の図にあるように再編成されるので、RNAを逆転写した場合、もとのDNA断片には戻らず、もっと短い断片になります。
ゲノムの配列決定で、ウイルスを単離しない場合は、ヒトの細胞が入ったままで配列決定して、得られたデータから、ヒトのDNA由来の配列を取り除く操作が行われるらしいのですが、この時、再編成してできたRNAから逆転写されたDNAは取り除かれなくなるというわけです。
このRNAを、PCRで検出しているのだとしたら、肺炎が治ったら、マクロファージやＴ細胞も減少して、PCRも陰性となりますね。
気管支肺胞洗浄液にマクロファージやリンパ球が含まれているという、古き良き時代の文献を見つけました。
2020年3月20日受理
フランス・リヨンの市民病院
Molecular characterization of SARS-CoV-2 in the first COVID-19 cluster in France reveals an amino acid deletion in nsp2 (Asp268del)
タイトル『フランスでの最初のCOVID-19クラスタ―におけるSARS-CoV-2分子キャラクタリゼーションにより、nsp2（非構造タンパク質２）においてアミノ酸欠失が明らかになった』
抄訳
欧州における最初の症例の内の6例は、2020年1月下旬のフレンチアルプスでの感染クラスタ―に関する。
患者０はシンガポールからフランス経由で英国に帰国し、2月6日に陽性であることが判明した。
このケースと関連するフランスのクラスターについて、メタゲノム次世代シーケンシングを行った。
陽性だった6人の接触者の内、ウイルス量が高い３つの検体を選んだ。
2月7日に上気道感染症を発症した患者から鼻咽頭スワブを1つ採取（サンプル＃1、Ct = 31.3）、他の2つの検体は、1人の無症状の患者から、2月8日（サンプル＃2、鼻咽頭スワブ、Ct = 31.1）および9日（サンプル＃3、鼻咽頭吸引液、Ct = 28.8）に採取した。
（訳注： 6人の陽性者のうち、ウイルス量が高いのが2人のみだった）
平均19 445 767のリードが生成され、そのうちサンプルあたり平均605 243のリードがSARS-CoV-2リファレンスゲノムにマッピングされました。 100xの最小カバレッジ深度でカバーされるゲノムの割合は、サンプル＃1が38.3％、サンプル＃2が99.6％、サンプル＃3が80.6％でした。
サンプル#2のゲノムGISAID (EPI_ISL_410486)
このサンプルは、1月19日中国の江蘇のサンプル(EPI_ISL_408488)のクラスターに入る。
参照SARS-CoV-2配列と比較して、1607–1609位置のオープンリーディングフレーム１a(ORF1a)に３つの拡散の欠失があり、この欠失はこの位置をカバーするリードの100％でみつかった。この欠失のまわりのシーケンシング深度は1745xであった。
この欠失は、サンプル#1と #3のリードにも100％みつかっている。この変異は、 非構造タンパク質２のアミノ酸268の欠失となり、3月17日現在で報告されているゲノム571のうちの37(6.1%)に見られた。この欠失を含むゲノムの１５が中国で2019年12月から2020年2月の間に採取されており、 オランダでも23ウイルスが更に多少の変異があるがみつかっている。
同一無症状患者から2日続けて採取したサンプル#2と#3を比較すると、3つの1 塩基置換変異がみつかったC366A (nsp1: S34Y), A20475G (synonymous mutation in nsp15), and T24084A (protein S: L841H)。
宿主内のウイルス進化を示唆している。
このアミノ酸欠失は、2月の英国のウイルスと、3月のオランダのウイルス合計37ウイルスで見つかっている。
Asp268欠失の及ぼす感染性や病原性への影響、ＰＣＲ検査および抗ウイルス薬開発戦略について、早急に評価すべきである
本日の大橋先生のビデオのコメント欄に
字幕大王様のビデオが紹介してありました
デビッド・クロウ インタビュー
この中で、デビットさんが
「ヒトのRNAはすべてが配列決定されているわけではない」と述べていました。
DNAが転写されるときに、配列がそのまま転写されるわけでは無くて、再編成が起こることがあるので、このRNAが試料に入っていたら、ウイルスのRNAと一緒にrtPCRした後、ヒトのゲノムに対応するDNA配列を除いても、再編成が起こった部分のDNAはそのまま残ってしまうということを言っているのだと思います。
ワクチン副反応の死亡例に肺炎が含まれることは稀なのだろうか
65歳以上のワクチン副反応死亡例
ワクチン別では、インフルエンザと肺炎球菌が多い
2014年にピークがあって、2019年と2020年は少ない
英国の日毎の発症数が減少し始めたのは、5月中旬以降でした。
死亡数は、4月下旬から減少し始めています。
イングランドの15歳から44歳の超過死亡数のグラフ
横軸のWeek 17 は、2020年4月20日から始まる週です。
この年代層の超過死亡数は、4月中旬から急減しました。
シリア人の医師が、抗生物質で治療するように頼んで回復したニュースが流れたのは、4月20日でした。
英国保健省のページに、細菌感染が疑われたときは、ドキシサイクリンの使用が奨励されたのは、4月23日。
5月1日には、市中感染の中程度から重症患者に抗生物質の使用ガイダンスを発表。
英国の新型コロナ死亡者には、抗生物質で改善する肺炎が多数含まれていたのではないかと疑われます。
VAERSの5月のHPVワクチン（シルガード９）副反応報告も、日付不明の5件だけだった
桃井先生に伝えないと！
テキサス大学の論文の参考文献１０は、
originally published online April 17, 2020
Science 29 May 2020: Vol. 368, Issue 6494, pp. 1012-1015
オランダのエラスムス大学 （不吉な大学）
タイトル『ヒト以外の霊長類モデルにおける、COVID-19, MERSおよびSARSの病理発生比較』
サマリーの部分に「low-passage clinical isolate of SARS-CoV-2 」を使用したと書いてあり、
実験のセクションによると
「First, two groups of four cynomolgus macaques [both young adult (young), 4 to 5 yearsof age; and old adult (aged), 15 to 20 years of age] were inoculated by a combined intra-tracheal (IT) and intranasal (IN) route with a SARS-CoV-2 strain from a German traveler returning from China. 」
中国から戻ったドイツ人旅行者からのSARS-CoV-2株ということです。
カニクイザルで、ウイルス量の増加はみられても、臨床症状は1匹で鼻水程度だったようです。
「low-passage clinical isolate」というのは、臨床サンプルから継代培養を数回した単離体ということでしょうか。このisolateを日本語で単離体と訳していいのかは甚だ疑問です。
テキサス大学の論文の参考文献１１は、
米国NIH、2020年3月21日投稿
タイトル『SARS-CoV-2を接種したアカゲザルにおける呼吸器疾患とウイルス排出』
実験のセクション
「Eight adult rhesus macaques were inoculated with a total dose of 2.6×106 TCID50 of SARS-CoV-2 isolate nCoV-WA1–202018 via a combination of intratracheal, intranasal, ocular and oral routes. On day 1 post inoculation (dpi), all animals showed changes in respiratory pattern and piloerection, as reflected in their clinical scores (Fig. 1a). Other observed signs of disease included reduced appetite, hunched posture, pale appearance and dehydration (Table S1). Disease signs persisted for more than a week, with all animals completely recovered between 9 and 17 dpi (Fig. 1a and Table S1). Weight loss was observed in all animals (Fig. 1b); body temperatures spiked on 1 dpi but returned to normal levels thereafter (Fig. 1c).」
使用したウイルスは、nCoV-WA1–202018単離ウイルスとうことです。
「Virus and cells
SARS-CoV-2 isolate nCoV-WA1–2020 (MN985325.1)18 (Vero passage 3) was kindly provided by CDC and propagated once in VeroE6 cells in DMEM (Sigma) supplemented with 2% fetal bovine serum (Gibco), 1 mM L-glutamine (Gibco), 50 U/ml penicillin and 50 μg/ml streptomycin (Gibco) (virus isolation medium). The used virus stock was 100% identical to the initial deposited genbank sequence (MN985325.1) and no contaminants were detected. VeroE6 cells were maintained in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, 1 mM L-glutamine, 50 U/ml penicillin and 50 μg/ml streptomycin.」
CDCから提供されたSARS-CoV-2 isolate nCoV-WA1–2020 (MN985325.1)18（Vero細胞で3回継代したもの）を、もう一度VeroE6細胞で増殖して使用したようです。
ＷＡ１なので、米国のワシントン州の最初の患者からのウイルスで、CDCが単離したと言っているものと同じだと思います。
テキサス大学の論文の参考文献１２は、
武漢ウイルス研究所 Posted 27 Feb, 2020
タイトル『新型コロナウイルス(SARS-CoV-2)感染は、アカゲザルで肺炎をおこす』
「Six RM (1–6) between the ages of 6 and 12 years, three males and 3 females, were inoculated with 7×106 50% tissue-culture infectious doses (TCID50) of SARS-CoV–2 」
6-12齢の6匹のアカゲザルに、SARS-CoV–2を接種したということ。
「Virus, cell and antibody
SARS-CoV–2 (IVCAS 6.7512) was isolated from a bronchoalveolar lavage fluid collected from a patient with viral pneumonia in December 2019 in Wuhan, China. The virus isolation was propagated in Vero E6 cells (ATCC® CRL–1586™) in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum, 1 mM L-glutamine, 100 international units (IU)/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin and cultured at 37°C in 5% CO2. The virus was harvested on day 3 post infection. The anti-RP3-CoV N protein antibody was made in house. And Cy3-conjugated goat-anti-rabbit IgG was purchased Abcam. 」
2019年12月にウイルス肺炎患者から採取された気管支肺胞洗浄液から単離。
この単離したものを、VeroE6細胞で増殖させたということ。
単離についての詳細は無し。
テキサス大学の論文の参考文献１３は、
中国北京協和医学院と中国CDC 2020年3月12日受理
タイトル『年齢関連COVID-19アカゲザルモデル』
使用したウイルスは、中国CDCのHB-01株。既に出てきたもので、単離したかどうか怪しいものでした。
「Professor Tan from the China Centners for Disease Control and Prevention (China CDC) warmly afforded the SARS‐CoV‐2 named strain HB‐01. The complete genome for this SARS‐CoV‐2 had been put in to GISAID (BetaCoV/Wuhan/IVDC‐HB‐01/2020|EPI_ISL_402119). This strain was stored in the China National Microbiological Data Center (accession number NMDC10013001 and genome accession numbers MDC60013002‐01). Vero cells were used for the reproduction of SARS‐CoV‐2 stocks. Vero cells are maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 IU/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin, and incubated at 37°C, 5% CO2. Titers for SARS‐CoV‐2 were resolved by a 50% tissue‐culture infectious doses (TCID50) assay.」
以上、テキサス大学の論文で動物モデルについての参考文献をみましたが、ウイルス単離の手順を詳細に述べているものはありませんでした。
テキサス大学の論文の参考文献9を見てみます。
参考文献９
2020年2月27日受理
韓国の忠北大学
タイトル『フェレットにおけるSARS-CoV-2の感染と急速な伝播』
症状は発熱、鼻腔、気管、肺、小腸でウイルス抗原確認、致死性無し。
実験の部分ですが、
「Growth and Isolation of Virus
Virus was isolated from an isolate of SARS-CoV-2 from a COVID-19 confirmed patient in Korea. To infect the animal, viruses were propagated on the Vero cells in the DMEM medium (GIBCO) supplemented with 1%penecillin/streptomycin (GIBCO) and TPCK trypsin (0.5ug/mL; Worthington Biochemical) at 37°C for 72 h. Propagated viruses were stored at −80°C freezer for future usage.」
COVID-19と確認された韓国の患者からのSARS-CoV-2単離体から単離ということです。忠北大学の研究室で単離したわけではないようです。
フェレットからのウイルス単離の部分でも、
「To evaluate the infectious virus titer in each specimen, collected nasal washes and saliva specimens were inoculated onto Vero cells for virus isolation. In IN infected ferret group, NMC-nCoV02 was isolated from both saliva and nasal washes specimens as early as 2 dpi and persisted until 4 and 6 dpi, respectively 」
ウイルス単離のために、鼻洗浄液と唾液から採取された検体を、Vero細胞に接種した。とあって、フェレットからの採取検体をそのまま培養に使用しているようです。
SARS-CoV-2単離体をどこから得たのかの詳細な記載はありませんが、参考文献で韓国の最初の患者についての論文があることがわかりましたので、これにあたってみました。
Viral Load Kinetics of SARS-CoV-2 Infection in First Two Patients in Korea
『韓国における最初の2人の患者でのSARS-CoV-2感染のウイルス量動態学』
韓国での最初の患者は、35歳の中国人女性、2020年1月19日入国、一日前より発熱(38.3°C)、悪寒、筋肉痛があった。詳細は、文献７を参照することとなっていますので、文献７をみてみました。
Received January 31, 2020; Accepted February 02, 2020
Incheon Medical Center J Korean Med Sci 2020;35(5):e61
タイトル『中国武漢から韓国に輸入された2019新型コロナウイルス肺炎の最初の症例：感染防御方法に関して』
この文献にも、細胞培養、ウイルス単離に関しての記述はありませんでした。
ここまで調べても、韓国の患者1号からのウイルス単離体に関する詳細な情報は得られませんでした。
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6月22日追記（大橋先生のビデオで解説されたものhttps://www.youtube.com/watch?v=FYK5uHsH8iQ&t=295s）
Received February 11, 2020; Accepted February 17, 2020.
『Virus Isolation from the First Patient with SARS-CoV-2 in Korea』
タイトル「韓国におけるSARS-CoV-2最初の患者からのウイルス単離」
The patient's oropharyngeal samples were obtained by using UTM™ kit containing 1 mL of viral transport media (Copan Diagnostics Inc., Murrieta, CA, USA) on day 7 of her illness. We inoculated monolayers of Vero cells (ATCC ® CCL-81™) with the samples and cultured the cells at 37°C in a 5% carbon dioxide atmosphere. Until 5 days after inoculation, cytopathic effects were not distinct, which is compatible with the previous findings that no specific cytopathic effects were observed in the Vero E6 cells until 6 days after inoculation in the report about first isolation of SARS-CoV-2.3 Five days after inoculation, we did blind passage of culture supernatant into T-25 culture flask (ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) with monolayers of Vero cells, and cytopathic effects consisting of rounding and detachment of cells were observed in the whole area of the T-25 flask 3 days after the first blind passage (Fig. 1A and B).
(BetaCoV/Korea/SNU01/2020) 武漢の参照ゲノムからの変異９
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上の文献のページに、参考文献としてではなく、「興味あるかもしれないから読んでみたらリスト」に、ウイルスを単離したというタイトルの中国の論文のリンクがありました。
2020年3月16日受理
広州医科大学
タイトル『COVID-19患者の尿からの感染性SARS-CoV-2の単離』
Although viral RNA can be detected in multiple organs in COVID-19 patients, infectious SARS-CoV-2 has only been isolated from respiratory specimens [3,4].
ウイルスＲＮＡは多数の臓器から検出可能であるが、これまでは、呼吸器サンプルからのみ単離されていた（文献３，４）
尿サンプルの単離実験
「RT–PCR positive urine specimens (Ct 34) from day 12 p.i. was serially diluted in infection media and inoculated onto Vero E6 cells. Cytopathic effects (CPE) were clearly observed after 3 days (Figure 1B). Full-length viral genome sequence was acquired by next-generation sequencing (Accession number MT446312) with 5 nucleotide mutations as compared to the original Wuhan viral stain (Accession number NC045512.2) (Table S1).」
感染12日後に患者から採取したPCRで陽性だった尿サンプルを、感染培地で段階的に希釈し、VeroE6細胞に播種した。細胞変性効果が3日後に観察された。次世代配列決定により全ウイルスゲノムを得、最初の武漢の株と比較して核酸変異が5カ所あった。
Cell culture supernatant was negatively stained and visualized by transmission electron microscopy (TEM). Spherical-shaped particles with distinct surface projections, resembling spikes, that were consistent with SARS-CoV-2 virions as published previously (Figure 1C) were observed [1]. Viral load in respiratory specimens and urine were quantitated by RT–PCR. Viral loads decreased over time in oropharyngeal swabs.
細胞培養液の上澄みから、ＴＥＭ撮影して、スパイクのある粒子を確認。定量ＰＣＲでウイルス量測定、口咽頭スワブサンプルで時間と共に減少したことが観察された。
以上でした。
尿に含まれている他の微生物がどれくらい除去できているのかは不明でした。
尿のマイクロバイオームについて
Advances in Understanding the Human Urinary Microbiome and Its Potential Role in Urinary Tract Infection
