京都大学大学院医学研究科
初期診療・救急医学分野
准教授 松田直之
はじめに
敗血症などの感染症がどのようにして臓器炎症を進展させるかの病態生理を考える際に，Toll-like receptor（TLR）は不可欠な受容体である。1996年にLemaitreら1）によりCell誌に報告されたショウジョウバエのToll受容体の自然免疫における関与などを発端として，Toll受容体に類似したTLRが哺乳類に同定されたことは，全身性炎症を病態生理学的に理解する上での大きな功績となった。現在，TLRはヒトで11種類，マウスで13種類がクローニングされ2, 3），自然免疫や獲得免疫に対する役割に加えて，臓器炎症を説明するための危機感知受容体（danger-sensing receptor）として認識されるようになった。
TLRは病原体の含有する分子パターン（PAMPs：pathogen-associated molecular patterns）を認識する受容体ファミリーの一つであり，pattern recognition receptor（PRR）である。T細胞などの免疫機構に関与する一方で，主要臓器細胞においてもnuclear factor-κB（NF-κB）やactivator protein-1（AP-1）などの転写因子を活性化させ，ケモカイン，炎症性サイトカイン，炎症性物質などを転写段階で発現調節する。主要臓器の細胞では，必ずしもすべての細胞でTLRなどのPRRが発現しているわけではないものの，TLRを細胞膜に発現する鋭敏な細胞が主要臓器の組織群に存在する。これらのTLRを発現する主要臓器の細胞は，炎症に対する危機感知に働き，ケモカインなどの炎症性警笛を発する警笛細胞（inflammatory alert cell）として機能する。本講座では，現在当分野の研究内容に側して，TLRシグナルを介した血管内皮細胞の病態生理を論じる。
Toll-like receptorとリガンド
TLRシグナルを惹起するリガンドは，TLRのサブタイプにより異なることが知られている。図1は，これらの受容体サブタイプとリガンドの関係の一部を模式化したものである。TLRのサブタイプのすべてが細胞膜上で機能するわけではないことも知られており，細胞膜上でリポペプチドを認識するサブタイプはTLR1, 2, 4, 6である3）。グラム陽性菌やグラム陰性菌や真菌の細胞壁にはリポペプチドが存在するが，TLR2はグラム陽性菌のリポテイコ酸4），TLR4はグラム陰性菌のリポポリサッカライドを細胞膜上で認識する5, 6）。また，TLR1，TLR2，TLR6はヘテロ二量体となることで，マイコプラズマ由来のリポタンパクやリポペプチドを細胞膜上で認識する7-10）。現在，TLR1-TLR2複合体はトリアシル化リポペプチド（PAM3CSK4）を8, 9），TLR2- TLR6複合体はジアシル化リポペプチド（PAM2CSK4）を10）リガンドとすることも知られている。サルモネラ，セラチア，ヘリコバクターピロリなどの鞭毛を持つ細菌では，この鞭毛に含有されるフラジェリンが細胞膜上でTLR5により認識される11）。
これに対して，細菌やウイルスや自己の核酸に反応するTLRとして，主にエンドソームなどの細胞内コンポーネントに局在するTLR3, 7, 8, 9が知られている。TLR3は2本鎖RNAを12），TLR7とTLR8は1本鎖RNAを13, 14），TLR9は5’-AACGTT-3’，5’-GACGTC-3’，5’-AGCGCT-3’などのCpG配列（5’-CG-3’）を15），樹状細胞などの免疫担当細胞に限らず，肺などの主要臓器の細胞内においても認識する。
このように，TLRは，細菌やウイルスの含有成分を認識することができるが，その他の物質も認識することが知られている。フィブリノーゲン，ヒアルロナン，フィブロネクチン，タキソール，HSP60，HSP70などは，TLR4のリガンドとなる2, 3）。
Toll-like receptorを発現する警笛細胞
緑膿菌や大腸菌などのグラム陰性桿菌は，集中治療をはじめとした重症患者管理において，重症敗血症の原因となりやすい。グラム陰性菌感染症において炎症発現のトリガーとなるTLR4の発現密度は，主要臓器では，肺，右心房，腎臓，肝臓の順に高いことが確認できる。肺や右心房にはTLR4やTNF受容体などの炎症性受容体が高密度で発現しているため，グラム陰性桿菌敗血症の初期に，肺や右心房では炎症性警笛が鳴りやすい傾向がある。また，敗血症の進展により腎臓の尿細管上皮でTLR4発現が増加する傾向がある。こうした腎臓でのTLR4の発現増加には，macrophage migration inhibitory factor（MIF）の腎尿細管再吸収が関与する可能性が確認できる。盲腸結紮穿孔やグラム陰性菌内毒素のlipopolysaccharide（LPS）などの刺激における腎尿細管レベルのTLR4の増加は，MIFノックアウトマウスで抑制される。MIFはTLR4を転写段階で増加させる物質の一つであり16），腎臓のみならず，肺17）や腸18）などにおいてもTLR4の転写を亢進させることが確認されている。このように，MIFのような炎症過程で産生される物質は，正常状態で TLR4の発現密度の高い肺などの臓器から腎臓へ，臓器炎症強度を時系列でシフトさせる作用を持つ。肺や心房筋では，TLR刺激により活性化された警笛細胞よりケモカインが産生され，白血球系細胞の浸潤が高まる。こうした白血球系細胞の浸潤の炎症増強作用を伴い，肺では誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の産生が著明に高まり，血管透過性が亢進し，肺酸素化能が低下しやすい。心房筋では，プロスタグランジンの産生が高まり頻脈傾向が助長される。腎臓では，全身性炎症の進行とともに尿細管上皮細胞に炎症が高まり，急性腎不全が惹起される。
一方，同種の組織群を免疫組織学的手法で評価すると，炎症の生じていない組織群では，たとえ組織学的に同一と分類される細胞であっても，TLRの発現はさまざまである。培養細胞や組織標本の免疫組織染色像では，TLR4が主要臓器において最も高い分布密度を示す細気管支レベルであっても，TLR4を細胞膜に発現するものは約35%レベルに過ぎない。気管支上皮細胞の培養細胞系においては，TLR4を細胞膜上に発現させるものは約30%を超えるレベルにすぎず，ゴルジ体周辺に発現をとどめるものが約40%レベル，核内にとどまるものや全く発現しないものが約30%近く存在する。しかし，TLR4やTLR2は，炎症性刺激によりゴルジ体から微小管を通じて，細胞膜上に移動する傾向が免疫組織染色像で観察できる19）。このTLRの細胞膜シフトは，糖鎖修飾蛋白protein associated with TLR4（PART4）などの細胞膜固定化作用以外に，ラジカルスカベンジャー，NF-κBデコイ核酸やPKC阻害薬でも抑制される。ラジカルを介したNF-κBの活性化による輸送刺激物質の産生や，PKC活性化によるキネシンモーター系の活性化などの関与が示唆される。
このように主要臓器では，組織学的に同種の細胞と評価されても，細菌構成要素を認識するTLRを細胞膜に発現させる細胞は一部に過ぎない。この一部の警笛細胞が，転写段階からケモカインや接着分子などの産生を高めることで，好中球やマクロファージなどの白血球系浸潤細胞を炎症部位に集積させる。そして，炎症性サイトカインと炎症性受容体を介した炎症の増強によりTLRを細胞膜に発現させる「警笛細胞」が増加し，主要臓器細胞内においても炎症の場のスライドシフトが生じ，主要臓器は警笛細胞群として炎症性強度を高める19）。このような状況において，血管内皮細胞も，炎症増強の戦場となる19, 20）。
Toll-like receptorとアダプター分子
細胞膜上に発現するTLR1/2/ 4/6などのTLRは，interleukin-1（IL-1）受容体やIL-18受容体と共通のToll-IL-1 receptor（TIR）homology domain という細胞質内ドメインを持つ。TLRの細胞外ドメインはロイシンを豊富に持つleucine rich repeat構造を基盤とし，IL-1受容体の細胞外ドメインはイムノグロブリン構造に類似したIg-like domainを持つ。両者に共通する細胞質内のTIRドメインは約160のアミノ酸で構成されており，機能面でBox1，Box2，Box3の3領域に区分されている21）。Box 1は機能的中核領域であり，Box 2はプロリンを豊富に含有するため下流の情報伝達系へのシグナル伝達やTLRの2量体化に関与する。現在，Box 3に関しては，十分な機能解析が進んでいない。このように，TLRシグナルは主にTIRドメインのBox 2領域を介して，myeloid differentiation factor 88（MyD88），MyD88 adapter like（MAL），TIR domain-containing adapter protein inducing IFN-α（TRIF），TRIF-related adapter molecule（TRAM）の4つをアダプター分子として，転写因子NF-κBやAP-1を活性化させると考えられている。現在，TIRアダプタードメインファミリーは，これら4種のほかにTIRに抑制的に作用するSIGIRR22）と ST223）が知られているが，これらの機能は十分に確定されていない。
これら4つの促進的に作用するアダプター分子のうち，296アミノ残基で構成されるMyD88は，TLR3を除くTLRの主なアダプター分子として知られ，IL-1 receptor associated kinase 4（IRAK4）との強い会合能力を持つ24）。このMyD88は，TLRシグナルの中核を担うものではあるが，MyD88ノックアウトマウスの研究より，必ずしもTLRを介した炎症性シグナルを完全に制御するものではないことが示唆されている25）。LPS刺激によるTLR4シグナルにおいては，MyD88以外のTRAM-TRIFシグナルによりNF-B活性が遅延して上昇することが確認されている25）。
一方，MALはTIR domain-containing adaptor protein（TIRAP）とも呼ばれ，MyD88よりN末端領域が75塩基分短い分子として知られている26）。このMALはphosphatidylinositol 4,5-bisphosphate（PIP2）により細胞膜での接着を高め，TLR4やTLR2などの細胞膜固定を高め，MyD88との会合率を高める可能性がある26, 27）。MALノックアウトマウスでは，TLR5，TLR7，TLR9のリガンド刺激には応答するものの，TLR4，TLR2，TLR1，TLR6のシグナルが損なわれることが報告されている28）。特に非炎症時にTLR2はゴルジに集積する傾向があり，必ずしも細胞膜に固定化されていない特徴があるが，MALは細胞膜へのTLR2などの細胞膜輸送や細胞膜上への固定化に関与するようだ。
さらに，TLR4とTLR3の細胞内シグナルに関しては，MyD88を介さないTRIF29）とTRAM30）の関与が強く示唆されている。TRIFは712アミノ酸より，TRAMは253アミノ酸より構成され，TRAMはN末端がミリストイル化することで細胞膜上での安定を高め，TRIFへのシグナルを介して，MyD88に依存しない経路でIFN-αやIFN-βを産生する30）。また，TRIFはFADDを介してアポトーシスを誘導する可能性が示唆されている31）。TRIFノックアウトマウスを用いた解析では，大腸菌による肺でのNF-κB活性やMAPK活性が抑制される32）ことより，肺などの主要臓器のTLR4シグナルにおいてもTRIFは重要なアダプター分子と考えられている。また，TLR3のシグナルでは，TRAM-TRIFは主なアダプター蛋白であり，TANK-binding kinase 1やIκB kinase へのシグナルを介して，interferon regulatory factor 3（IRF3）の活性化を介して，IFN-αやinterferon activated gene-10（IP-10）を産生することが知られている33）。一方，TRAM欠損マウスでは，TLR2，TLR7，TLR9の炎症性サイトカイン産生に影響を与えないことが確認されており30），TRAM-TRIF経路がTLR2，TLR7，TLR9シグナルに関与する可能性は低いと考えられている。
血管内皮細胞とToll-like receptorシグナル
ヒトの血管内皮細胞にはTLR2やTLR4のみならず34, 35），TLR136），TLR337, 38），TLR539），TLR640）が存在することが知られている。これに対して，TLR7，TLR8，TLR9はマウスの血管内皮細胞では検出できるものの41, 42），ヒト血管内皮細胞ではmRNAレベルでも検出されにくく，正常状態では存在しても微量と評価されている43）。また，TLRのアダプター蛋白であるMyD8835），TIRAP/MAL44），TRIF45）に関してはヒト血管内皮細胞に存在するが，TRAMの発現はヒト血管内皮細胞で微量であるためにヒト血管内皮細胞ではTRAM-TRIFを介したTLRシグナルは極めて微弱と考えられている45）。このように，現在，TRAM-TRIFを介したTLRシグナルは，ヒト血管内皮細胞ではTRAM発現が少ないために惹起されにくい。さらに，炎症病態において，TRAM発現が亢進し，血管内皮細胞炎症を増強させる可能性が示唆されるが，この可能性も低いようである。我々のヒト肺静脈血管内皮細胞の細胞培養系での解析では，CD14存在下に100 ng/mL レベルのLPSを3時間刺激し，NF-κB活性とAP-1活性が高まる状態を作成しても，その血管内皮細胞群にTRAM蛋白は検出されない結果を得た。一方，LPSの腹腔内投与24時間後のマウスの肺では，TRAM mRNAの軽度の上昇が認められ，これはMAPK阻害薬やAP-1デコイ核酸で抑制された。
以上を踏まえると，血管内皮細胞では白血球系細胞や主要臓器の警笛細胞とは異なり，TLRシグナルは主にMal-MyD88を介して惹起され，TRAM-TRIFを介した経路の関与は極めて微弱であると考えられる。
血管内皮細胞のToll-like receptorを介した転写因子活性
ヒト血管内皮細胞におけるTLRシグナルは，マウスとは異なり，上述のようにMAL-MyD88を介したTLR1/2/4/5/6シグナルが主体と考えられる。図2には，現在ヒト血管内皮細胞培養系で確認できる細胞内情報伝達をまとめた。結果的に，これらのシグナルは，少なくとも2つの転写因子NF-κBおよびAP-1を活性化することも確認できている。
NF-κBは，RelA（p65），RelB，c-Rel，NF-κB1（p105/p50），およびNF-κB2（p100/p52）の5つで構成されるRel/NF-κBファミリーの総称である 46）。これらNF-κBの5つサブユニットは，ホモあるいはヘテロ2量体を形成し，非活性状態では主に細胞質内でinhibitory κB（I-κB）ファミリー（と結合し，核内の10塩基からなるNF-κB領域（GGGACTTTCC）との結合が阻害されている。TLRを介したNF-κB活性化は，主に図2の細胞内情報伝達を介して達成される。NF-κB活性化の結果として，血管内皮細胞で転写が亢進する物質を表に示した。Tumor necrosis factor a（TNF-α），Interleukin-1β（IL-1β），IL-2，IL-6などの炎症性サイトカイン，一酸化窒素（NO）を過剰産生させる誘導型NO合成酵素（inducible nitric oxide synthase: iNOS），プロスタサイクリンなどのプロスタノイドを産生させる誘導型シクロオキシゲナーゼ（inducible cyclooxygenase-2: COX2），ロイコトリエン産生に関与する5-lipoxygenase，白血球の遊走や浸潤に関与するケモカインや接着分子，さらにはvonWillebrand因子，tissue factor，plasminogen activator inhibitor-1などの凝固活性化物質が，NF-kB活性に依存して転写を高める。特に，血管内皮細胞においては，産生されたTNF-αやIL-1βが，それらの受容体を介してNF-κB活性をさらに高める。このように，炎症性物質産生の根源に，NF-κB活性が関与することは，血管内皮細胞炎症を理解する上でも重要と考えられる。
一方，AP-1遺伝子群は， Jun，Fos，activating transcription factor（ATF），musculoaponeurotic fibrosarcoma（MAF）の4つのファミリーで構成される。これらのAP-1遺伝子群のうち，マウスのLPS静脈内投与による大動脈などの血管内皮細胞では，特にJunがJun-N-terminal protein kinase（JNK）によりリン酸化を受けやすい。リン酸化されたJunのホモ2量体や，JunのFosとのヘテロ2量体は ，DNA上のAP-1領域として知られるphorbol 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-responsive element（TPA- responsive element：TRE）との結合を高め，また，Jun/AFT複合体はcAMP-responsive element（CRE）に結合し，COX-2，接着分子などの炎症性マーカー，matrix metalloproteinase（MMP-1，MMP-3，MMP-9）などのプロテアーゼや，アクチンフィラメント伸展に関与するCapG，Ezrin，Krp-1，Mts-1などを転写段階で増加させる47）。さらに重要な点として，AP-1活性は，血管内皮細胞においても，外因性にアポトーシスを進行させるDeath受容体ファミリーの細胞膜発現を高めることが観察できる。このようなAP-1はNF-kBより遅れて活性を高めることが観察でき，血管内皮細胞においても，NF-kB活性が鎮下する時期にAP-1活性がピークを迎え，アポトーシスが誘導されやすい。
以上のように，TLRシグナルは血管内皮細胞においても，NF-κB活性を介してケモカインを放出するAlertシグナルとして作用し，炎症性細胞を局所誘導させる一方で，独自に炎症や凝固を高める。さらに，TLRシグナルはAP-1活性を介して，アポトーシスを惹起し，炎症性警笛を発した後に細胞死を誘導させる。以上より，血管内皮細胞の保護の観点からは，少なくともNF-κBとAP-1活性を抑制する必要があるが，血管内皮細胞はグルココルチコイド受容体の発現が乏しいため48），これら転写因子の抑制をグルココルチコイドに期待できないのが現状である。図2におけるTNF-receptor–associated factor 6（TRAF6）やtumor growth factor-α associated kinase 1（TAK1）などの選択的阻害薬の開発が期待される。
おわりに
本稿では，TLRを細胞膜上に発現する細胞を警笛細胞と定義し，この警笛細胞で惹起される細胞内シグナルを，アダプター分子の観点より論じた。ヒトの血管内皮細胞には，TLRサブタイプのうちTLR1/2/4/5/6が認められる。また，ヒトの血管内皮細胞のTLRの主なアダプター蛋白は，MALとMyD88である。これらのリガンド刺激は，主にTRAF6やTAK1を介して，転写因子NF-κBやAP-1の活性を高め，炎症，凝固，および細胞死を誘導する。TLRシグナルを介した血管内皮細胞炎症の過程において，TRAF6やTAK1をターゲットとした創薬が期待される。
初期診療・救急医学分野
准教授 松田直之
はじめに
敗血症などの感染症がどのようにして臓器炎症を進展させるかの病態生理を考える際に，Toll-like receptor（TLR）は不可欠な受容体である。1996年にLemaitreら1）によりCell誌に報告されたショウジョウバエのToll受容体の自然免疫における関与などを発端として，Toll受容体に類似したTLRが哺乳類に同定されたことは，全身性炎症を病態生理学的に理解する上での大きな功績となった。現在，TLRはヒトで11種類，マウスで13種類がクローニングされ2, 3），自然免疫や獲得免疫に対する役割に加えて，臓器炎症を説明するための危機感知受容体（danger-sensing receptor）として認識されるようになった。
TLRは病原体の含有する分子パターン（PAMPs：pathogen-associated molecular patterns）を認識する受容体ファミリーの一つであり，pattern recognition receptor（PRR）である。T細胞などの免疫機構に関与する一方で，主要臓器細胞においてもnuclear factor-κB（NF-κB）やactivator protein-1（AP-1）などの転写因子を活性化させ，ケモカイン，炎症性サイトカイン，炎症性物質などを転写段階で発現調節する。主要臓器の細胞では，必ずしもすべての細胞でTLRなどのPRRが発現しているわけではないものの，TLRを細胞膜に発現する鋭敏な細胞が主要臓器の組織群に存在する。これらのTLRを発現する主要臓器の細胞は，炎症に対する危機感知に働き，ケモカインなどの炎症性警笛を発する警笛細胞（inflammatory alert cell）として機能する。本講座では，現在当分野の研究内容に側して，TLRシグナルを介した血管内皮細胞の病態生理を論じる。
Toll-like receptorとリガンド
TLRシグナルを惹起するリガンドは，TLRのサブタイプにより異なることが知られている。図1は，これらの受容体サブタイプとリガンドの関係の一部を模式化したものである。TLRのサブタイプのすべてが細胞膜上で機能するわけではないことも知られており，細胞膜上でリポペプチドを認識するサブタイプはTLR1, 2, 4, 6である3）。グラム陽性菌やグラム陰性菌や真菌の細胞壁にはリポペプチドが存在するが，TLR2はグラム陽性菌のリポテイコ酸4），TLR4はグラム陰性菌のリポポリサッカライドを細胞膜上で認識する5, 6）。また，TLR1，TLR2，TLR6はヘテロ二量体となることで，マイコプラズマ由来のリポタンパクやリポペプチドを細胞膜上で認識する7-10）。現在，TLR1-TLR2複合体はトリアシル化リポペプチド（PAM3CSK4）を8, 9），TLR2- TLR6複合体はジアシル化リポペプチド（PAM2CSK4）を10）リガンドとすることも知られている。サルモネラ，セラチア，ヘリコバクターピロリなどの鞭毛を持つ細菌では，この鞭毛に含有されるフラジェリンが細胞膜上でTLR5により認識される11）。
これに対して，細菌やウイルスや自己の核酸に反応するTLRとして，主にエンドソームなどの細胞内コンポーネントに局在するTLR3, 7, 8, 9が知られている。TLR3は2本鎖RNAを12），TLR7とTLR8は1本鎖RNAを13, 14），TLR9は5’-AACGTT-3’，5’-GACGTC-3’，5’-AGCGCT-3’などのCpG配列（5’-CG-3’）を15），樹状細胞などの免疫担当細胞に限らず，肺などの主要臓器の細胞内においても認識する。
このように，TLRは，細菌やウイルスの含有成分を認識することができるが，その他の物質も認識することが知られている。フィブリノーゲン，ヒアルロナン，フィブロネクチン，タキソール，HSP60，HSP70などは，TLR4のリガンドとなる2, 3）。
Toll-like receptorを発現する警笛細胞
緑膿菌や大腸菌などのグラム陰性桿菌は，集中治療をはじめとした重症患者管理において，重症敗血症の原因となりやすい。グラム陰性菌感染症において炎症発現のトリガーとなるTLR4の発現密度は，主要臓器では，肺，右心房，腎臓，肝臓の順に高いことが確認できる。肺や右心房にはTLR4やTNF受容体などの炎症性受容体が高密度で発現しているため，グラム陰性桿菌敗血症の初期に，肺や右心房では炎症性警笛が鳴りやすい傾向がある。また，敗血症の進展により腎臓の尿細管上皮でTLR4発現が増加する傾向がある。こうした腎臓でのTLR4の発現増加には，macrophage migration inhibitory factor（MIF）の腎尿細管再吸収が関与する可能性が確認できる。盲腸結紮穿孔やグラム陰性菌内毒素のlipopolysaccharide（LPS）などの刺激における腎尿細管レベルのTLR4の増加は，MIFノックアウトマウスで抑制される。MIFはTLR4を転写段階で増加させる物質の一つであり16），腎臓のみならず，肺17）や腸18）などにおいてもTLR4の転写を亢進させることが確認されている。このように，MIFのような炎症過程で産生される物質は，正常状態で TLR4の発現密度の高い肺などの臓器から腎臓へ，臓器炎症強度を時系列でシフトさせる作用を持つ。肺や心房筋では，TLR刺激により活性化された警笛細胞よりケモカインが産生され，白血球系細胞の浸潤が高まる。こうした白血球系細胞の浸潤の炎症増強作用を伴い，肺では誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の産生が著明に高まり，血管透過性が亢進し，肺酸素化能が低下しやすい。心房筋では，プロスタグランジンの産生が高まり頻脈傾向が助長される。腎臓では，全身性炎症の進行とともに尿細管上皮細胞に炎症が高まり，急性腎不全が惹起される。
一方，同種の組織群を免疫組織学的手法で評価すると，炎症の生じていない組織群では，たとえ組織学的に同一と分類される細胞であっても，TLRの発現はさまざまである。培養細胞や組織標本の免疫組織染色像では，TLR4が主要臓器において最も高い分布密度を示す細気管支レベルであっても，TLR4を細胞膜に発現するものは約35%レベルに過ぎない。気管支上皮細胞の培養細胞系においては，TLR4を細胞膜上に発現させるものは約30%を超えるレベルにすぎず，ゴルジ体周辺に発現をとどめるものが約40%レベル，核内にとどまるものや全く発現しないものが約30%近く存在する。しかし，TLR4やTLR2は，炎症性刺激によりゴルジ体から微小管を通じて，細胞膜上に移動する傾向が免疫組織染色像で観察できる19）。このTLRの細胞膜シフトは，糖鎖修飾蛋白protein associated with TLR4（PART4）などの細胞膜固定化作用以外に，ラジカルスカベンジャー，NF-κBデコイ核酸やPKC阻害薬でも抑制される。ラジカルを介したNF-κBの活性化による輸送刺激物質の産生や，PKC活性化によるキネシンモーター系の活性化などの関与が示唆される。
このように主要臓器では，組織学的に同種の細胞と評価されても，細菌構成要素を認識するTLRを細胞膜に発現させる細胞は一部に過ぎない。この一部の警笛細胞が，転写段階からケモカインや接着分子などの産生を高めることで，好中球やマクロファージなどの白血球系浸潤細胞を炎症部位に集積させる。そして，炎症性サイトカインと炎症性受容体を介した炎症の増強によりTLRを細胞膜に発現させる「警笛細胞」が増加し，主要臓器細胞内においても炎症の場のスライドシフトが生じ，主要臓器は警笛細胞群として炎症性強度を高める19）。このような状況において，血管内皮細胞も，炎症増強の戦場となる19, 20）。
Toll-like receptorとアダプター分子
細胞膜上に発現するTLR1/2/ 4/6などのTLRは，interleukin-1（IL-1）受容体やIL-18受容体と共通のToll-IL-1 receptor（TIR）homology domain という細胞質内ドメインを持つ。TLRの細胞外ドメインはロイシンを豊富に持つleucine rich repeat構造を基盤とし，IL-1受容体の細胞外ドメインはイムノグロブリン構造に類似したIg-like domainを持つ。両者に共通する細胞質内のTIRドメインは約160のアミノ酸で構成されており，機能面でBox1，Box2，Box3の3領域に区分されている21）。Box 1は機能的中核領域であり，Box 2はプロリンを豊富に含有するため下流の情報伝達系へのシグナル伝達やTLRの2量体化に関与する。現在，Box 3に関しては，十分な機能解析が進んでいない。このように，TLRシグナルは主にTIRドメインのBox 2領域を介して，myeloid differentiation factor 88（MyD88），MyD88 adapter like（MAL），TIR domain-containing adapter protein inducing IFN-α（TRIF），TRIF-related adapter molecule（TRAM）の4つをアダプター分子として，転写因子NF-κBやAP-1を活性化させると考えられている。現在，TIRアダプタードメインファミリーは，これら4種のほかにTIRに抑制的に作用するSIGIRR22）と ST223）が知られているが，これらの機能は十分に確定されていない。
これら4つの促進的に作用するアダプター分子のうち，296アミノ残基で構成されるMyD88は，TLR3を除くTLRの主なアダプター分子として知られ，IL-1 receptor associated kinase 4（IRAK4）との強い会合能力を持つ24）。このMyD88は，TLRシグナルの中核を担うものではあるが，MyD88ノックアウトマウスの研究より，必ずしもTLRを介した炎症性シグナルを完全に制御するものではないことが示唆されている25）。LPS刺激によるTLR4シグナルにおいては，MyD88以外のTRAM-TRIFシグナルによりNF-B活性が遅延して上昇することが確認されている25）。
一方，MALはTIR domain-containing adaptor protein（TIRAP）とも呼ばれ，MyD88よりN末端領域が75塩基分短い分子として知られている26）。このMALはphosphatidylinositol 4,5-bisphosphate（PIP2）により細胞膜での接着を高め，TLR4やTLR2などの細胞膜固定を高め，MyD88との会合率を高める可能性がある26, 27）。MALノックアウトマウスでは，TLR5，TLR7，TLR9のリガンド刺激には応答するものの，TLR4，TLR2，TLR1，TLR6のシグナルが損なわれることが報告されている28）。特に非炎症時にTLR2はゴルジに集積する傾向があり，必ずしも細胞膜に固定化されていない特徴があるが，MALは細胞膜へのTLR2などの細胞膜輸送や細胞膜上への固定化に関与するようだ。
さらに，TLR4とTLR3の細胞内シグナルに関しては，MyD88を介さないTRIF29）とTRAM30）の関与が強く示唆されている。TRIFは712アミノ酸より，TRAMは253アミノ酸より構成され，TRAMはN末端がミリストイル化することで細胞膜上での安定を高め，TRIFへのシグナルを介して，MyD88に依存しない経路でIFN-αやIFN-βを産生する30）。また，TRIFはFADDを介してアポトーシスを誘導する可能性が示唆されている31）。TRIFノックアウトマウスを用いた解析では，大腸菌による肺でのNF-κB活性やMAPK活性が抑制される32）ことより，肺などの主要臓器のTLR4シグナルにおいてもTRIFは重要なアダプター分子と考えられている。また，TLR3のシグナルでは，TRAM-TRIFは主なアダプター蛋白であり，TANK-binding kinase 1やIκB kinase へのシグナルを介して，interferon regulatory factor 3（IRF3）の活性化を介して，IFN-αやinterferon activated gene-10（IP-10）を産生することが知られている33）。一方，TRAM欠損マウスでは，TLR2，TLR7，TLR9の炎症性サイトカイン産生に影響を与えないことが確認されており30），TRAM-TRIF経路がTLR2，TLR7，TLR9シグナルに関与する可能性は低いと考えられている。
血管内皮細胞とToll-like receptorシグナル
ヒトの血管内皮細胞にはTLR2やTLR4のみならず34, 35），TLR136），TLR337, 38），TLR539），TLR640）が存在することが知られている。これに対して，TLR7，TLR8，TLR9はマウスの血管内皮細胞では検出できるものの41, 42），ヒト血管内皮細胞ではmRNAレベルでも検出されにくく，正常状態では存在しても微量と評価されている43）。また，TLRのアダプター蛋白であるMyD8835），TIRAP/MAL44），TRIF45）に関してはヒト血管内皮細胞に存在するが，TRAMの発現はヒト血管内皮細胞で微量であるためにヒト血管内皮細胞ではTRAM-TRIFを介したTLRシグナルは極めて微弱と考えられている45）。このように，現在，TRAM-TRIFを介したTLRシグナルは，ヒト血管内皮細胞ではTRAM発現が少ないために惹起されにくい。さらに，炎症病態において，TRAM発現が亢進し，血管内皮細胞炎症を増強させる可能性が示唆されるが，この可能性も低いようである。我々のヒト肺静脈血管内皮細胞の細胞培養系での解析では，CD14存在下に100 ng/mL レベルのLPSを3時間刺激し，NF-κB活性とAP-1活性が高まる状態を作成しても，その血管内皮細胞群にTRAM蛋白は検出されない結果を得た。一方，LPSの腹腔内投与24時間後のマウスの肺では，TRAM mRNAの軽度の上昇が認められ，これはMAPK阻害薬やAP-1デコイ核酸で抑制された。
以上を踏まえると，血管内皮細胞では白血球系細胞や主要臓器の警笛細胞とは異なり，TLRシグナルは主にMal-MyD88を介して惹起され，TRAM-TRIFを介した経路の関与は極めて微弱であると考えられる。
血管内皮細胞のToll-like receptorを介した転写因子活性
ヒト血管内皮細胞におけるTLRシグナルは，マウスとは異なり，上述のようにMAL-MyD88を介したTLR1/2/4/5/6シグナルが主体と考えられる。図2には，現在ヒト血管内皮細胞培養系で確認できる細胞内情報伝達をまとめた。結果的に，これらのシグナルは，少なくとも2つの転写因子NF-κBおよびAP-1を活性化することも確認できている。
NF-κBは，RelA（p65），RelB，c-Rel，NF-κB1（p105/p50），およびNF-κB2（p100/p52）の5つで構成されるRel/NF-κBファミリーの総称である 46）。これらNF-κBの5つサブユニットは，ホモあるいはヘテロ2量体を形成し，非活性状態では主に細胞質内でinhibitory κB（I-κB）ファミリー（と結合し，核内の10塩基からなるNF-κB領域（GGGACTTTCC）との結合が阻害されている。TLRを介したNF-κB活性化は，主に図2の細胞内情報伝達を介して達成される。NF-κB活性化の結果として，血管内皮細胞で転写が亢進する物質を表に示した。Tumor necrosis factor a（TNF-α），Interleukin-1β（IL-1β），IL-2，IL-6などの炎症性サイトカイン，一酸化窒素（NO）を過剰産生させる誘導型NO合成酵素（inducible nitric oxide synthase: iNOS），プロスタサイクリンなどのプロスタノイドを産生させる誘導型シクロオキシゲナーゼ（inducible cyclooxygenase-2: COX2），ロイコトリエン産生に関与する5-lipoxygenase，白血球の遊走や浸潤に関与するケモカインや接着分子，さらにはvonWillebrand因子，tissue factor，plasminogen activator inhibitor-1などの凝固活性化物質が，NF-kB活性に依存して転写を高める。特に，血管内皮細胞においては，産生されたTNF-αやIL-1βが，それらの受容体を介してNF-κB活性をさらに高める。このように，炎症性物質産生の根源に，NF-κB活性が関与することは，血管内皮細胞炎症を理解する上でも重要と考えられる。
一方，AP-1遺伝子群は， Jun，Fos，activating transcription factor（ATF），musculoaponeurotic fibrosarcoma（MAF）の4つのファミリーで構成される。これらのAP-1遺伝子群のうち，マウスのLPS静脈内投与による大動脈などの血管内皮細胞では，特にJunがJun-N-terminal protein kinase（JNK）によりリン酸化を受けやすい。リン酸化されたJunのホモ2量体や，JunのFosとのヘテロ2量体は ，DNA上のAP-1領域として知られるphorbol 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-responsive element（TPA- responsive element：TRE）との結合を高め，また，Jun/AFT複合体はcAMP-responsive element（CRE）に結合し，COX-2，接着分子などの炎症性マーカー，matrix metalloproteinase（MMP-1，MMP-3，MMP-9）などのプロテアーゼや，アクチンフィラメント伸展に関与するCapG，Ezrin，Krp-1，Mts-1などを転写段階で増加させる47）。さらに重要な点として，AP-1活性は，血管内皮細胞においても，外因性にアポトーシスを進行させるDeath受容体ファミリーの細胞膜発現を高めることが観察できる。このようなAP-1はNF-kBより遅れて活性を高めることが観察でき，血管内皮細胞においても，NF-kB活性が鎮下する時期にAP-1活性がピークを迎え，アポトーシスが誘導されやすい。
以上のように，TLRシグナルは血管内皮細胞においても，NF-κB活性を介してケモカインを放出するAlertシグナルとして作用し，炎症性細胞を局所誘導させる一方で，独自に炎症や凝固を高める。さらに，TLRシグナルはAP-1活性を介して，アポトーシスを惹起し，炎症性警笛を発した後に細胞死を誘導させる。以上より，血管内皮細胞の保護の観点からは，少なくともNF-κBとAP-1活性を抑制する必要があるが，血管内皮細胞はグルココルチコイド受容体の発現が乏しいため48），これら転写因子の抑制をグルココルチコイドに期待できないのが現状である。図2におけるTNF-receptor–associated factor 6（TRAF6）やtumor growth factor-α associated kinase 1（TAK1）などの選択的阻害薬の開発が期待される。
おわりに
本稿では，TLRを細胞膜上に発現する細胞を警笛細胞と定義し，この警笛細胞で惹起される細胞内シグナルを，アダプター分子の観点より論じた。ヒトの血管内皮細胞には，TLRサブタイプのうちTLR1/2/4/5/6が認められる。また，ヒトの血管内皮細胞のTLRの主なアダプター蛋白は，MALとMyD88である。これらのリガンド刺激は，主にTRAF6やTAK1を介して，転写因子NF-κBやAP-1の活性を高め，炎症，凝固，および細胞死を誘導する。TLRシグナルを介した血管内皮細胞炎症の過程において，TRAF6やTAK1をターゲットとした創薬が期待される。
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