基礎研究 核タンパク抽出プロトコール

核タンパク抽出法
Nuclear protein extraction from 100 mg of tissue

Reagent: CelLytic NuCLEAR Extraction Kit
Product Code NXTRACT (SIGMA)

1 Dilute the l M DTT solution to 0.1 M with deionized, sterile water.
2 Prepare lx Lysis Buffer
 For tissues tested by Sigma the hypotonic buffer works better than the isotonic. Therefore, it is recommended to prepare lx Lysis Buffer, hypotonic. If the tissue is found to be too fragile, one can use the lx Lysis Buffer,isotonic.
 Add 10 μL of the prepared 0.1 M DTT solutionand 10μl of the protease inhibitor cocktail to 1000μL of lx Lysis Buffer.


3 Rinse the tissue twice with PBS buffer. Discard the PBS.

4 Resuspend the tissue gently in 1000μL (5X PCV) of the lx Lysis Buffer (containing DTT and protease inhibitors).　

5 Homogenize the tissue until more than 90% of the cells are broken and nuclei are visualized under the microscope　

6 Centrifuge the disrupted cells in suspension for 20 minutes at 10000-11000 x g.　

7 Transfer the supernatant to a fresh tube. This fraction is the cytoplasmic fraction.

8 Add 1.5μL of the prepared 0.1 M DTT solution and 1.5μL of the protease inhibitor cocktail to 147μL of the Extraction Buffer.
8.1 Note:If one wishes to extract nuclei proteins with a lower salt concentration　the Extraction Buffer may be diluted with lx Dilution and Equilibration buffer.

9 Resuspend the crude nuclei pellet in ～140 µl(2/3X PCV of Extraction Buffer containing DTT and protease inhibitor. At this stage a short homogenization can be performed to facilitate nuclear extraction.

10 Shake gently for 30 minutes.

11 Centrifuge for 5 minutes at 20000-　21000 x g　

12 Transfer the supernatant to a clean, chilled tube.

13 Snap-Freeze the supernatant in aliquots with liquid nitrogen and store at　-70 ℃.　


シグマ核たんぱく質抽出キットプロトコール

100 mgの組織からの核タンパク質抽出
サンプルの重量に応じて各試薬の使用量を比例計算して，用いて下さい。

1. 滅菌した脱イオン水を用いて１MのDTTを0.1Mに希釈して下さい。

2. 1X Lysis Bufferの準備
・組織サンプルの場合にはl x Lysis Buffer, hypotonicを用いています。非常に壊れやすい組織の場合には，l x Lysis Buffer，isotonicを使用することもできます。
・10μLの0.1 M DTTと10μLのプロテアーゼインヒビターカクテルを1,000 μLのl x Lysis Buffer に添加して下さい。

3. 組織サンプルをPBSで２回リンスして下さい。使用したPBSは捨てます。

4. 1,000 μL（5X PCV）のl x Lysis Buffer （DTTとプロテアーゼインヒビターカクテルを含む）で組織サンプルを穏やかに再懸濁します。

5. 90%以上の細胞が壊れて，核が現れるのを顕微鏡下で確認できるまで，組織をホモジネートして下さい。

6. 手順5の懸濁液を10,000-11,000 x gで20分間，遠心して下さい。

7.上澄を新しいチューブに移して下さい。この分画が細胞質分画になります。

8. 1.5 μLの0.1 M DTT溶液と1.5μLのプロテアーゼインヒビターカクテルを，147 μLのl x Extraction Buffer に入れて下さい。低塩濃度で目的タンパク質の抽出する必要がある場合は，Extraction Bufferをl x Dilution and Equilibration Bufferで希釈して用います。

9.手順７で得られた未精製の核ペレットを140 μL以下（2/3X PCV）のExtraction Buffer（DTTとプロテアーゼインヒビターカクテルを含む）で再懸濁します。この時に軽くホモジネートをすると，核タンパクの抽出を促進することができます。

10. 穏やかに30分間シェイクします（松田購入 オートシャーカ使用）。

11. 20,000-21,000 x gで5分間，遠心します。

12. 上澄を冷えた新しいチューブに移して下さい。

13. 液体窒素で上澄を瞬間冷凍させ，－80 °Cで保存して下さい。

脱塩処理
本プロトコールの手順で行うと，抽出された核タンパクは高塩濃度のExtraction Buffer中に存在しするようです。通常，高塩濃度のバッファー中にある抽出されたタンパクは，低濃度のバッファー（l x Dilution and Equilibration Buffer）で希釈をすることができます。また，高塩濃度中にある抽出されたタンパク質は濃縮されているため，EMSAやフットプリント法などの分析には少量で充分です。反応液に対して使用する抽出液量が少ないため，反応液中で塩は自然に希釈されます。実験上で塩によって影響が出る場合には，脱塩ゲルろ過カラムを用いて塩を除去します。この脱塩カラムにはDTT溶液を含んだl x Dilution and Equilibration Bufferが必要です。その場合，プロテアーゼインヒビター力クテルを溶出したタンパク溶液に添加して下さい。塩は透析によって除去できることもあります。その場合，lx Dilution and Equilibration Buffer（最終濃度が1 mMのDTTと，プロテアーゼインヒビターカクテルまたは0.5 m MAEBSFを含む）のような透析用バツフアーを使用して，核抽出溶液を透析します。

基礎研究 DNAラベリング

AP-1ゲルシフトアッセイのためのAP-1オリゴのラベリング
DNA Consensus Oligonucleotide Labeling

Reagents：
1）DNA Consensus Oligonucleotide (AP-1)
AP-l consensus oligonucleotide (Sigma Product NO. A9590)　を使用　
（平滑末端のオリゴヌクレオチド, double stranded ,21 bases x 2=42 bases）

5'- CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA -3'
3'-GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT -5'

AP-l consensus oligonucleotide is supplied as dry, blunt-ended double-stranded synthetic oligonucleotide.
When reconstituted in 20 μl of H2O，the final concentration is l.75 pmole/μl (1.75 μM) and is ready to be end labeled with polynucleotide kinase. (total 35 pmoles)

10 μL of H2Oに溶かせば3.5 μM，あるいは14 μl of H2Oに溶かせば2.5μM（2.5 pmole/μL）となる。

2) T4 polynucleotide kinase (Takaraを使用) ：10 units/μL (total volume 50 μL)
注意：T4 polynucleotide kinaseはMg要求性であり，5 mM DTTにて最大活性を示す。リン酸ナトリウムで50％阻害されるとともに，基質の末端形状と塩基配列の影響を受けることに注意する。
The above protocol can be applicable when using oligonucleotide with　blunt or 3'-protruding end， however, the labeling efficiency in that case may be lower than that in a reaction using single-stranded nucleotide or one wifh 5'-protruding end.

10x Polynucleotide kinase buffer　1 ml添付
添付試薬組成(保存: -20°C)
　　　　10XT4 Polynucleotide Kinase buffer
　　　　　　　　　500mM Tris・HCI,　pH8.0
　　　　　　　　　100mM　MgCl2
　　　　　　　　　50mM　DTT　　　　　　

3) γ-32P ATP (MP biomedicalを使用)
比活性166.5TBq/mmol, 370 MBq/ml (4500 Ci/mmol, 10 μCi/μl )

4) QIAquick nucleotide removal kit (Qiagen を使用)


A-1) labeling procedure

Labeling reaction：Total 10μl
H2O : 4.9μL
10x T4-PNK buffer : 1μL
　　2.5μM DNA : 1μL 　　( 2.5 pmoles)
γ-32P ATP ：2.5μL ( 25μCi )
　　T4-PNK ：0.6μL　　（6 units）
　　　↓pipetting
37°C for 30min
　　　↓50°C for 15min
　　　↓spin-down



Removal of unincorporated AP-l consensus oligonucleotide

QIAquick Nucleotide Removal Kitプロトコール

マイク口遊心機を利用する方法
酵素反応液（英語版Handbook 8ページ）では，放射性物質，ビオチン，DIGで標識したDNAフラグメントあるいは17 mer以上のオリゴヌクレオチドのクリーンアップ用に，プロトコールがデザインされているようです。

実験を始める前の重要事項　　　　　　　　　　　　　　　
■　使用前にエタノール（96～100％）をBuffer PEに添加します（添加量は試薬瓶のラベルを参照）。
■　すべての遠心ステップは，一般的な卓上マイクロ遠心機を用いて室温で行います。

操作手順
1. 反応サンプルに10倍容量のBuffer PN を入れ混和する。
例えば反応サンプル50μLに Buffer PN 500μL添加します。100 bp以上のDNAフラグメントでは5倍容量のBuffer PNを使用します。
2. 2 mlのコレクションチューブ（添付）にQIAquickスピンカラムをセットします。
3. DNAを結合させるために，サンプルをQIAquickカラムにアプライし，10,000×gで１分間遠心操作します。
4. 放射性サンプルの場合:
　　QIAquickカラムを新しい2 mLのコレクションチューブにセットし，放射性ろ過液を含むチューブは適切な方法で廃棄してください。
　非放射性サンプルの場合：
　　ろ過液を捨て，QIAquickカラムを同じチューブに戻してください。
　　コレクションチューブは，プラスチック廃棄物を減らすために再利用してください。
5. 放射性サンプルの場合:
QIAquickカラム洗浄のために，500μLのBuffer PEを添加し，10,000 × gで１分間遠心操作する。ろ過液を適切に廃棄し，さらに500μLのBuffer PEで洗浄を繰り返す。
　非放射性サンプルの場合:
　　QIAquickカラム洗浄のために，750μLのBuffer PEを添加し，10,000 × gで１分間遠心する。
6. ろ過液を捨て，空になった同じチューブにQIAquickカラムを戻す。10,000 × gでさらに１分間遠心操作する。
重要点：ろ過液を除去した後にもう一度この遠心操作を行わなければ，Buffer PE由来の残留エタノールを完全に除去できない点に注意してください。
7. 新しい1.5 mLのマイクロ遠心チューブにQIAquickカラムをのせる。
8. DNAの溶出のために，100～200μLのBuffer EB（10 mM Tris-Cl、pH 8.5）あるいは水をQIAquickメンブレン表面の中央に添加し，10,000 × gで１分間遠心する。あるいは，DNA濃度を高めるために，30～50μLの溶出バッフアーをQIAquickメンブレンの中央に添加し，1分間カラムを放置後，1分間遠心する。
重要：結合したDNAを完全に溶出するために，溶出バッフアーをQIAquickメンブレンに直接にアプライします。溶出効率は，pHに依存します。最大溶出効率はpH値がア.0～8.5で得られるようです。溶出に水を使用する場合には，pH値がこの範囲にあることを確認します。水では緩衝作用のないため，溶出したDNAが分解されやすいことを考慮して，-20℃で保存してください。
精製DNAはTE（10 mM Tris・Cl，l mM EDTA，pH 8.0）でも溶出できますが，EDTAが次に続く酵素反応を阻害することがあるので推奨しません。
9.精製したDNAをゲルで解析する際には，Loding Dyeに5倍容量の精製DNAを添加する。ゲルにアプライする前に数回ピペッティングし，よく混和する。
Loading dyeには3種類のマーカー色素（bromophenol blue，xylene cyanol，orange G）が入っており，DNAの移動距離の予測とアガロースゲルの泳動時間の至適化はかります。


Labeling reaction sample (10μL)
purification with the kit：QIAquick Nucleotide removal kit
　　　↓←buffer PN：44μL
　　onto column
　　　↓6000rpm、1min
　　set the column onto a new 2mL tube
　　　↓←buffer PE：500μL
　　　↓6000rpm, 1min
　　　↓→filtrate:discard
　　　↓←buffer PE：500μL
　　　↓6000rpm, 1min　
↓discard filtrate, then centrifuge again：6000rpm, 1min (very important to remove ethanol in Buffer PE)
set the column onto a new 1.5mL tube
　　　↓←buffer EB：60μL（onto column）
　　　↓1min at room temp ( for better recovery)
　　　↓6000 rpm, 5min
　　filtrate　　　　　 　　　
count： a new 1.5mL tubeに1μL添加後，直接ホルダーに入れて，カウントし，シンチレータは使わない。
binding reactionで10,000-30,000 cpm/μLになるように，水で希釈するための目安とする。

基礎研究 ゲルシフトアッセイ（AP-1）

ゲルシフトアッセイ
Mobility Shift Assay

Reaction with nuclear extract and γ-32P labeled AP-1 consensus oligonucleotide and/or antibody

Reagents：
The stability of DNA-protein complexes can be strongly affected by the choice of buffer, so it is worth trying different systems for the protein of interest. The most common buffers used are Tris-acetate-EDTA (TAE),Tris-glycine-EDTA (TGE), and Tris-borate-EDTA(TBE).The electrophoresis buffers are typically used at 0.5x，1.0x or 2.0x concentrations. The gel running buffer should match the buffer used to prepare the gel.


1）Non denaturing polyacrylamide gel (Ready Gel J for DNA 5%, 12 well) (BioRadを使用)
5% PAG, 20 μl /well (Max vol.)
25 mM Tris, pH 8.3
192 mM Glycine
1 mM EDTA

2）10x TGE ( Tris-glycine-EDTA):
10x TG (Sigma) に0.5M EDTA(pH8.0)(Sigma)を加えて当日調製する。
250 mM Tris, pH 8.3
1920 mM Glycine
10 mM EDTA

Electrophoresis buffer: 1x TGE

3) 5xLoading dye ( BioRad)
2 marker dyes (0.2% bromophenol blue, 0.2% xylene cyanol)
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
25% Glycerol
5　mM EDTA

4) 10x Binding buffer 自家調製する。
100 mM Tris-HCl, pH 7.5
400 mM NaCl
10 mM EDTA
40% glycerol
5 mM MgCl2
10 mM DTT
以上を混合したbuffer（0.05 ml/tube）を－30°Cで保存して使用する。

5)　poly dI-dC•poly dI-dC (poly(deoxyinosynic-deoxycitydylic)acid sodium salt (SIGMA);
double stranded alternating copolymer, 10 units
1 µg/µl

6) anti-c-Jun antibody (SantaCruz, c-Jun (D)X, sc-44を使用)
rabbit polyclonal IgG, affinity purified, 200µg in 100µl
a peptide mapping to a highly conserved DNA binding domain of c-Jun of mouse origin
about 2-fold excess of nuclear extract protein

7) anti-c-Fos antibody (SantaCruz, c-Fos (4)X, sc-52を使用) 200µg in 100µl
rabbit polyclonal IgG, affinity purified, a peptide mapping at the N-terminus of c-Fos of human origin
about 2-fold excess of nuclear extract protein
8) γ-32P 5' -end labeled AP-l consensus oligonucleotide, double stranded
T4 polynucleotide kinase (Takara)でラベルしたものを，QIAquick Nucleotide removal kitで精製したものを用いる。別記，RIラベルプロトコールを参照。
9) unlabeled AP-l consensus oligonucleotide, double stranded
2.5μM (2.5 pmole/μl): 60-100 fold excess of radioactive probe


Procedures of binding reaction and electrophoresis
＊核たんぱく質とpoly dI-dC，cold competitor DNA，anti-c-Fos antibody, anti-c-Jun antibodyの反応は松田生化学研究室で準備してから，RIセンターに移動する。
＊RIセンターでは，まず，先に作成したγ-32P 5' -end labeled AP-l consensus oligonucleotideを解凍する。

10 x buffer : 1.5μL
　1mg/mL poly dI-dC : 1μL
(cold competitor DNA : 0〜200ng---probeの200倍量（モル比） or DNA希釈液)
　H2O 　：final 15μL（probe添加後）
　　　↓on ice
　nuclear extract：1μg or dialysis buffer（等容量）
　　　↓mix by pipetting
　　　↓spin-down
(on ice for 10min)
　　　↓ここでRIセンターに移動する。
　γ-32P-DNA：10,000 cpm
　　　↓mix gently
　　　↓spin-down
incubate at room temp. or on ice for 30min
　　　↓←loading dye : 1.5μL　（10x dyeの場合）（今回はbuffer系が異なるので5x dye 3μL を加える）

Electrophoresis
1）pre-run：色素液を1μL加えた後，100V, 15min
2）電気泳動：50V, 30min→100V ---30min毎にピペットでbuffer撹拌
　　　＊サンプルのBPBがbottom近傍に来たら停止（probeが小さい場合，やや上で止めること）
電気泳動終了後、Gel-dry，autoradiography（BAS5000, X線フィルム）
1）plateを泳動槽からはずし，シリコナイズした板を上にして平面に置く
2）ゲル大のろ紙（3MMなど）をしわにならないようにゲル上に置く
3）ろ紙上から霧吹きで水を吹きかけ，ろ紙上から軽くなぞる
4）ろ紙をゲルと共にはがし，さらにもう一枚のろ紙にのせて，ゲルドライヤー上へ置く
5）ゲルをラップで覆い，さらにドライヤーのラバーをのせ，乾燥開始
　　　80℃，2 hr
6）乾燥後，ラップつきゲルが吸着したろ紙（1枚）をさらにラップで覆う
7）カセッテにイメージングプレート（IP）と共にセットし，BAS5000に30 min exposeする
8) BAS5000で結果を読み取り，結果をチェックする。
9）カセッテにフィルムと共にセットし，-70℃，1日間expose
10）フィルムを現像し，結果をファイルに残すこと


1. Remove the comb from the previously prepared 5％gel and set the gel in an electrophoresis unit.
2. Pre-run the gel without sample for 30-60 minutes at 10V/cm.
3. Prepare 5 kinds of marked tubes for AP-1 labeled consensus DNA:
　　　Tube0　Basic reaction to observe free probe ( γ-32Plabeled AP-1 consensus oligonucleotide)
Tube l　Basic reaction to observe shifted bands of DNA-protein complex
　　　Tube 2 Competition with unlabeled AP-1 to observe the interference or elimination of the specific shifted band
Tube 3 Competition with anti-c-Fos antibody to observe the interference of the specific shifted band
　　　Tube 4 Competition with anti-c-Jun antibody to observe the interference of the specific shifted band

4. Combine the reagents according to the following table: Total 15 μl (scale 1/2)

Reagents Tube Number
0 1 2 3 4
10x binding buffer 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl 1.5 μl
Poly(dI-dC)・poly(dI-dC)，1mg/mL 1 μl 1 μl 1 μl 1μl 1 μl
Water 11.5μl 9 μl 7μl 8 μl 8 μl
nuclear extract, 1 μg (about 0.4μg/μl) - - - - (2.5 μl) (2.5 μl) (2.5 μl) (2.5 μl)
Unlabeled AP-1consensus oligonucleotide，2.5 M - - - - - - - - 2μl - - - - - - - -
anti-c-Fos antibody, 2μg (2μg/μl) - - - - - - - - - - - - 1 μl - - - -
anti-c-Jun antibody, 2μg (2μg/μl) - - - - - - - - - - - - - - - - 1 μl
Incubate 60 minutes at 4°C ( on ice?), then add:
γ-32Plabeled AP-1 consensus oligonucleotide 1 μl 1 μl 1 μl 1μl 1 μl

Mix each tube gently by tapping the bottom of the tube with a finger. Avoid introducing bubbles in the mix. Spin the tubes in a microcentrifuge for few seconds.

Incubate the reaction tubes for 30 minutes at room temperature.

6. After incubation, add approx. 3 μl of loading buffer to each tube.

7. Stop the pre-run of the gel started in Step 2.

8. Load the contents of each tube into separate wells on the gel.
There is no stacking gel in the system, so precise loading with minimum mixing of the buffer is necessary to obtain sharp bands.
Washing the wells with running buffer prior to loading the samples is recommended;
empty the wells by inverting the gel on blotting paper，
Allow the sample (~30 μl) to fall along one side of the well to prevent dilution of the sample and avoid bubbles in the well.

9. Carefully add running buffer to the wells with a pipet and then add buffer to the upper electrophoresis chamber.

10. Electrophorese at 10V/cm to give a clear separation of the free labeled DNA consensus and the DNA-protein complexes.
　　Stop the gel run when the dye is 2/3 of the way through the gel.

基礎研究 DNA抽出法

プロトコール
動物組織からのトータルDNA精製（スピンカラム・プロトコール）

DNeasy Tissue Kit (QIAGEN)を用いています。

実験を始める前の重要事項
・ すべての遠心操作はマイクロ遠心機を用いて室温（15～25℃）で行う。
・ ボルテックス操作は5～10秒のパルス・ボルテックスを行う。

実験を始める前の準備事項
・ Buffer ATLおよびBuffer Alは保存中に沈殿物を形成することがあるので，その場合は56℃に加熱して沈殿物を完全に溶かす。
・ Buffer AW1およびBuffer AW2は濃縮液となっているので，最初に使用する前に容器に記載されているように適切な量のエタノール（96～100%）を加えて，ワーキング溶液を調製する。
・ ステップ2で使用するサーモミキサーを前もって56℃に設定する。
・ 凍結サンプルを使用する場合は，サンプルを室温にする。DNAのサイズが短くなるのでサンプルの解凍・融解を繰り返してはいけない。

操作手順
1． 組織20 mg（肺，心房筋，心室筋，肝臓，脾臓，腎臓，脳，尾など）を細かくカットし，1.5 mlのマイクロ遠心チューブに入れる。180 µlのBuffer ATLを添加する。
2． Proteinase K を20 µlを添加後，ボルテックス操作をして混和し，組織が完全に溶解するまで56℃でインキュベートする（溶解は通常1～3時間で，げっ歯類の尾では6～8時間）。サンプルを効率的に溶解するためにサーモミキサー（松田科研購入）を使用すること。
3． 15秒間ボルテックス操作をする。200 µlのBuffer ALをサンプルに添加し，ボルテックス操作で十分にミックスする。200 µlのエタノール（96～100%）をサンプルに添加し，再びボルテックス操作で完全に均一な溶液になるように十分にミックスする。
4． ステップ3の混合液（形成した沈殿物を含む）を新しい2 mlコレクションチューブ（添付）中のDNeasy Miniスピンカラムに移す。6,000×g（松田遠心器であれば8000 rpm）以上で1分間遠心操作する。ろ液とコレクションチューブを捨てる。
5． DNeasy Miniスピンカラムを新しい2 mlコレクションチューブ（添付）に移し、500µlのBuffer AW1を添加し，6,000×g（8,000rpm）で1分間遠心分離する。ろ液およびコレクションチューブを捨てる。
6． DNeasy Miniスピンカラムを新しい2 mlコレクションチューブ（添付）に移し，500 µlのBuffer AW2を添加し，20,000×g（14,000rpm）で3分間遠心して，DNeasyメンブレンを完全に乾燥させる。ろ液とコレクションチューブを捨てる
7． DNeasy Miniスピンカラムを新しい1.5 mlあるいは2 mlマイクロチューブに移し，200 µlのBuffer AEをDNeasyメンブレン上に直接ピペットで添加する。室温で1分間インキュベートした後，6,000×g（8,000rpm）以上で1分間遠心分離し，溶出させる。DNA収量を最大にするためには，この溶出操作をもう一度繰り返し，約400µlのDNAサンプルを回収する。

基礎研究 RT-PCRプロトコール

RNA抽出編

必要試薬
Tri-reagent
70%EtOH (DEPC処理水使用)
Isopropanol
Chloroform (イソアミルアルコールなどの添加物なし)
DEPC処理水

１． 組織をRNaseフリーのエッペンドルフチューブに回収し（max 20 mgレベルの重量にとどめること），100~200 μlのTri-reagent に入れ，ホモゲナイズ。（4℃）
２． Tri-reagentを追加し，800 μlにする。（最初から800μlだとホモゲナイズが難しい）
３． -80℃へ。この状態で一ヶ月程度保存可能（できればすぐに用いる方がよい。なお，このステップは細胞破砕も兼ねているので，すぐに実験を行う場合にも，行った方がよいと思います。）
４． 5分間室温放置で融解させる。
５． Chloroform （IAAなどの添加物がないもの）を200 μlを加え，30 秒間，Vortex.
６． 5分間氷上放置
７． 遠心分離　12000 g 15 min（松田生化学研究室にて）
８． 上の水槽（透明な層）をピペットマンを用いて分離。中間層の白いもやもやはタンパク層であり，混入しないように注意すること。
９． Isopropanolを800μl加えVortex。
１０． 30分以上4℃放置。（overnight可）
１１． 遠心分離　15000 g 15 min　白いペレットを目視で確認する。
１２． デカンテーション（エッペンドルフチューブを逆さにする）で上清を捨て，70％ エタノールを500μl加える。
１３． 遠心分離　15000 g 5 min
１４． デカンテーション（エッペンを逆さにする）で上清を捨て，ごみが入らないようにパラフィルムなどで上を塞ぎ，通気のための穴をあける（18G針使用）。室温で5~10分放置。残留エタノールをとばす。ペレットが乾ききると溶解しにくくなるため，乾ききらないように注意すること。
１５． DEPC処理水（松田作成済）を15~20 μlを加え，濃度測定（生命研究棟2階の共通機器室にあるnano dropが簡便）。用いるRNAは，OD 260/280 ratioが，1.8~2.0の範囲にあることを確認する。（なお，DEPC処理水のオートクレーブは，生化学実験室では行わないように注意すること。法医学のオートクレーブを借りています。）


RT-PCR編

必要試薬
SuperScript Ⅲ(invitrogen)
0.5 μg/μl Oligo dT primer (T12~18)
Taq polymerase RT-version (Takara)
各種 primer
40u /μl RNAse　inhibitor (Promega)


１． 各サンプルにおけるＲＮＡ濃度を合わせ，total 9 μlになるようにDEPC水で調整する。
２． dT primer　1 μl，2.5 mM dNTPmix　4 μlを，それぞれ加える。
３． 65℃　5 min →　4℃　（ポリＡとdT primerのアニーリング）（松田生化学研究室中のMy PCR中にpre RTというprotocol を設定してあります。）
４． ×5 RT用Bufferを4 μlを加える。
５． DTT 1 μlを加える。
６． RNase inhibitor, Superscript Ⅲを，それぞれ0.5μl加える。
７． 50℃　60 min →　75℃ 15min （My　PCR中のKageayma RTを使用する。）


反応液組成　(単位 μl)
Total 20 μl。
最大で5μgのtotal RNAを用いたRTが可能です。

RNA液　　 X
DEPC水　 ９－X
dT primer 1
dNTPmix 4
↓　65℃　5 min →　4℃
Buffer 5
DTT 1
RNasin 0.5
RT-enzyme 0.5
↓　50℃　60 min →　75℃　15 min
cDNA完成


＜注＞PCR反応について
PCR反応は各自で目的に応じて，プロトコールを修正してください。アニーリング温度，サイクル数，プライマー濃度は各実験系で最適条件が異なります。教科書的にはアニーリングはTm±2℃、プライマー濃度は0.2～0.5 μMが終濃度になります。
共通して使うことが多い松田・影山使用のbeta-actinのプライマーを用いる場合は，アニーリングは58.5~60℃，プライマー濃度は0.5 μMで，2 μg程度のRNAを用いてRTする場合には，32 サイクル程度で十分に検出できます。
また，研究室のprimerは影山先生と神山先生により，stock solutionを100 pmol/μl で作成し，10 μlずつ分注し，－20℃保存（数年持ちます）に保存されてあります。使用時は90 μlの水を加えてworking solutionとし，以降4℃保存（2週間程度使用可能）としてください。これを下記のようにtotal 25 μlのPCR液に1.25μl加えると20倍希釈となり，最終濃度0.5 μMとなります。


PCR反応液組成
　
単位はμl。
RT液は最大で2μlまで使用可能。
それ以上用いるとかえってPCR反応を阻害します。

Buffer 2.5
2.5mM dNTPmix 2.25
Primer (10 pmol/μl) 　F 1.25
　　 　　　　　　 R 1.25
Taq enzyme 0.125
RT液　　　　　　　　　 2
DDW 15.625

Total 25


Cycle template
95℃　　　30 sec

95℃　　　 15 sec
58.5℃　　 20 sec
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基礎研究 ギムザ染色によるBALF解析（肺の炎症評価の補助として）

ギムザ染色

BALFを500rpmで５分間遠心分離し，細胞分画のみとします。
これを500 µLのPBSに撹拌し，ギムザ染色を行います。
血球計算板（Fuchs Rosenthal type:深さ 0.2 mm）を用いて，総細胞数を調べます。計算板の四角に囲まれた領域は，松田研究室におけるものは0.2 µLとなりますので，少なくとも25領域の総数を調べ，100倍すれば，全回収細胞数となります。

（１）原　理

　ギムザ液は塩基性色素（メチレン青，アズール青など）と酸性色素（エオジン）との混合物です。アズールは，好塩基性物質である核のDNA，細胞質のRNA，アズール顆粒を青紫色に染めます。一方，エオジンは，好酸性物質であるヘモグロビンや好酸性顆粒などを赤橙色に染めます。血球の中の物質や構造タンパクは，この両色素に染色され，各血球に特徴的な染色像を呈するので，BALなどにおいても血球分画の評価に有用です。

（２）試　薬
4%ギムザ液（使用する際に作成します）
リン酸緩衝液（pH6.4）（PBS）に4 %の比率でギムザ液を混合して作成します。

（３）染色結果

核　…　赤紫色
細胞質　…　青色～淡青色
赤血球　…　赤～ピンク色
好酸性顆粒　…　赤色
好塩基性顆粒　…　青色