培養細胞からの細胞質タンパクおよび細胞膜タンパクの抽出

培養細胞からの細胞質タンパクおよび細胞膜タンパクの抽出（内御堂 亮・松田直之）

【準　備】

１． 作業はすべて氷上で行うため，十分量の氷を用意する。
２． －80℃で凍結していた細胞を4℃冷蔵庫で解凍する。
３． プロテアーゼインヒビタカクテル（SIGMA）を室温で解凍する。（時間がかかるので，まず，解凍を優先する。一度，解凍したものは10µLずつPCR用サンプリングチューブに小分けし，-20℃で専用ボックス内に保存する。）
４． 遠心機の温度を4℃に設定しておく。（温度が下がるのに時間がかかる可能性があるので，まず，やっておくこと。）
５． 十分量のHEPSバッファー（pH 7.5）を氷の中で冷やす。
６． ダウンス型ホモゲナイザを超純水で洗い，氷上で冷やしておく。
７． 廃液用のバッド，および，洗いに使う超純水ボトルを用意する。
８． ホモゲナイズのために用いる氷入りビーカーを用意する。（ホモゲナイザーが入る背の高い300~500 mLレベルの大きさのビーカーを選ぶとよい。）
９． ホモゲナイズしたサンプルを回収するエッペンドルフチューブを，サンプル群数の2倍数用意し，最終的保存に用いるチューブにはテプラⓡで作成した保存用のラベルを張る。（テプラⓡ：3行記載推奨；サンプル内容，群の特徴，作成日）（例：HMVEC，Glu 200 mg/dL 24h，07/06/12）

【全タンパク抽出】
作業はすべて氷上4℃で行うことを厳守すること。

１． 解凍した細胞が入ったマイクロチューブにHEPSバッファを300 μＬ入れる。
２． 続けてプロテアーゼインヒビターカクテルを3 μＬ入れる。
３． マイクロチューブ内の細胞をピペッティングする。
４． ピペッティングした細胞をピペットで回収し，ダウンス型ホモゲナイザに入れる。
５． ダウンス型ホモゲナイザで，上下20回，細胞をホモゲナイズする。すりつぶす感覚で行う。
６． 泡がおさまるまで，氷上でしばらく待つ。
７． 泡がおさまったら内容物をピペットで回収し，用意していたマイクロチューブに入れる。
８． ホモゲナイザーを超純水で洗う。（壷は超純水で最低3回は洗い，棒は一度キムワイプで付着物をふき取ってから，超純水でよく洗う）
９． 新しいサンプルで，2～8の肯定を繰り返す。
１０． ホモゲナイズされたサンプルを以下の条件で，遠心分離する。条件：4℃，600 g，10分間。松田研究グループは，チューブのヒンジを外側にするよう統一している。
１１． 遠心の間に，上清を回収するためのマイクロチューブを氷上に用意する。
１２． ヒンジの下の沈殿物を確認し，上清を回収し，全タンパクとする。沈殿物は核分画と未破砕細胞として，-80℃に保存する，あるいは，核タンパク回収系に持ち込む。