蛍光を観察

US2014242602
"[0644] Confocal Microscopy: 

[0645] Following treatment fluorescence of cells was observed using an inverted fluorescent confocal microscope (Leica SP5). Confocal images were acquired at the appropriate fluorescence emission peak of the bound high affinity species ( ̃530 nm). Images were uploaded into NIH ImageJ software. The fluorescence intensity of individuals cells from several random fields were measured and corrected for background. "

共焦点顕微鏡観察：処理後、倒立型蛍光共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ5）を用いて、細胞の蛍光を観察した。結合した高親和性種の適切な蛍光放出ピーク（約５３０ｎｍ）で共焦点画像を獲得した。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア中に画像をアップロードした。いくつかの無作為の視野からの個々の細胞の蛍光強度を測定し、バックグラウンドについて補正した。

US201371843
"[0141] Detection of FISH signals from a hybridized and washed sample can be accomplished to allow subsequent analysis in real time, such as by an operator who views fluorescence directly at a microscope, or to allow later analysis, by recording images. Detection generally involves the use of an appropriate source of excitation light for each fluorophore in use in the assay (e.g., light passed through an appropriate filter, or light from a laser of an appropriate wavelength); fluorescently emitted light is then passed through an appropriate filter, and it can be viewed directly by an operator and/or photographed with a camera, such as a film-based or digital camera, which may be connected to a computer. 

ハイブリダイズさせ、洗浄された試料からのＦＩＳＨシグナルの検出は、顕微鏡で直接、蛍光を観察するオペレーターによってなどのようにリアルタイムでの後の分析を可能にするためにまたは画像を記録することによる後の分析を可能にするために行うことができる。検出は、一般に、アッセイにおける使用においてそれぞれの蛍光団に対する励起光の適切な供給源の使用を伴い（たとえば、適切なフィルターを通過する光または適切な波長のレーザーからの光）、蛍光で放射された光は、次いで、適切なフィルターを通過し、それは、オペレーターによって直接、観察するおよび／またはコンピューターに接続されてもよいフィルムベースのもしくはデジタルカメラなどのようなカメラを用いて撮影することができる。

"[0142] 3. Enumeration 

[0143] The FISH signals of a plurality of nuclei in the sample are enumerated. In some embodiments, the plurality of nuclei comprises at least 50, 75, or 100 nuclei. Enumeration can be achieved, for example, by making a list containing an entry for each examined nucleus and how many of each of the FISH signals it contained, and/or by counting the number of nuclei that had each observed combination of FISH signal quantities. In some embodiments, such a list can contain possible but unobserved combinations of FISH signal quantities as well. The list can be reorganized by making entries for each observed combination of FISH signal quantities, accompanied by their frequency (see, e.g., Table 2 below). The information obtained by enumerating FISH signals is to be interpreted in view of at least one artifactual deletion frequency, discussed below. "

３．計数
  試料における複数の核のＦＩＳＨシグナルが、数えられる。いくつかの実施形態では、複数の核は、少なくとも５０、７５、または１００の核を含む。計数は、たとえば、それぞれの検査される核についてのエントリーおよびそれがそれぞれのＦＩＳＨシグナルをいくつ含有したかを含有するリストを作製することによってならびに／またはそれぞれ、ＦＩＳＨシグナル量の観察された組み合わせを有した核の数を数えることによって達成することができる。いくつかの実施形態では、そのようなリストは、同様に、ＦＩＳＨシグナル量の可能であるが観察されなかった組み合わせを含有することができる。リストは、それらの頻度を加えて、ＦＩＳＨシグナル量のそれぞれの観察された組み合わせについてのエントリーを作製することによって再編成することができる（たとえば下記の表２を参照されたい）。ＦＩＳＨシグナルを数えることによって得られた情報は、下記に説明される、少なくとも１つのアーチファクト欠失頻度を考慮して解釈されたい。

US2007071997
"To generate an AdSV25 carrying a marker gene, a GFP (green fluorescent protein) expression cassette previously cloned in the plasmid pShuttle (Clontech) was excised with the restriction enzymes I-Ceul and Pl-Scel and ligated into pSV25 (or another of the Ad chimp plasmids described herein) digested with the same enzymes. The resulting plasmid (pSV25GFP) was digested with Swal to separate the bacterial plasmid backbone and transfected into the E1 complementing cell line HEK 293. About 10 days later, a cytopathic effect was observed indicating the presence of replicative virus. The successful generation of an Ad SV25 based adenoviral vector expressing GFP was confirmed by applying the supernatant from the transfected culture on to fresh cell cultures. The presence of secondarily infected cells was determined by observation of green fluorescence in a population of the cells. "

マーカー遺伝子であるＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を保有するＡｄＳＶ２５を作製するために、以前にプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）にクローニングされた発現カセットを制限酵素Ｉ－ＣｅｕＩおよびＰＩ－ＳｃｅＩで切り出し、同酵素で消化されたｐＳＶ２５（または本明細書中に記載の別のＡｄ ｃｈｉｍｐプラスミド）にライゲーションした。得られたプラスミド（ｐＳＶ２５ＧＦＰ）をＳｗａＩで消化して細菌プラスミド主鎖を分離し、Ｅ１補完細胞株ＨＥＫ ２９３にトランスフェクトした。約１０日後、細胞変性効果が観察された。それは複製ウイルスの存在を示す。ＧＦＰを発現するＡｄ ＳＶ２５ベースのアデノウイルスベクターの作製の成功を、トランスフェクトされた培養由来の上清を新たな細胞培養に加えることによって確認した。該細胞集団中の緑色蛍光を観察することによって二次感染細胞の存在を判定した。