右肩上がり

US2017130261(JP)
"[0089] The fluorescence intensity for each cycle in the high speed, one-step reverse transcription real-time PCR was as shown in FIG. 7. When the initial concentrations of norovirus G1 and G2 genes are the same, similar sigmoid curves are obtained without depending on the type of reverse transcriptase used, and the number of cycles in which the fluorescence intensity rapidly amplified and rose was the same for both of the norovirus G1 and G2 genes. 

[0090] Next, high-speed, one-step reverse transcription real-time PCR was performed by changing the initial concentrations of the RNA of norovirus G1 and G2 genes. As shown in FIG. 8, the number of cycles in which fluorescence intensity rapidly amplified and rose varied depending on the initial concentration of the norovirus G1 gene. The number of cycles in which rapid amplification and rise of the fluorescence intensity are observed is in the order of highest to lowest initial concentration of RNA. Accordingly, the initial concentration of RNA can be generally quantified through Ct value, which is the number of cycles in which fluorescence intensity rapidly amplifies and rises. 

[0091] However, the amplification curve for the norovirus G1 gene shown in FIG. 8 confirms that the baseline is an upward-sloping curve in such a manner that the fluorescence intensity amplifies gently in accordance with thermal cycling, and then the fluorescence intensity rapidly increases from a certain number of cycles. Accordingly, it is difficult to estimate an accurate Ct value by using a usual method in which a certain level of fluorescence intensity is defined as the threshold and the number of cycles that provides a fluorescence intensity higher than the threshold is defined as the Ct value. "

[0075] 高速なOne-step逆転写リアルタイムＰＣＲにおけるサイクル毎の蛍光強度は、図７に示す通り、ノロウイルスのＧ１遺伝子及びＧ２遺伝子の初期濃度が同一であれば、逆転写酵素の種類に依存せず同様のシグモイド曲線を描き、蛍光強度が急激に増幅して立ち上がるサイクル数はそれぞれ一致した。 

[0076] 次に、ノロウイルスのＧ１遺伝子及びＧ２遺伝子のＲＮＡの初期濃度を変化させて、高速なOne-step逆転写リアルタイムＰＣＲの検討を行ったところ、図８に示す通り、ノロウイルスのＧ１遺伝子及びＧ２遺伝子のそれぞれについて、初期濃度に依存して蛍光強度が急激に増幅して立ち上がるサイクル数が変化した。この蛍光強度が急激に増幅して立ち上がるサイクル数は、ＲＮＡの初期濃度の順に並んでおり、そのため、蛍光強度が急激に増幅して立ち上がるサイクル数であるCt値により、ＲＮＡの初期濃度の定量が一般的に可能である。 

[0077] ただし、図８に示す、ノロウイルスのＧ１遺伝子に対する増幅曲線においては、サーマルサイクルに合わせ、なだらかに蛍光強度が増幅する形でベースラインが右肩上がりとなり、あるサイクル数から急激に蛍光強度が増加することが確認された。そのため、ある一定値の蛍光強度を閾値として、それを超えるサイクル数をCt値とする通常の方法では、正確なCt値を見積もることが困難である。