論文）WRKY75による花成時期制御

Transcription Factor WRKY75 Interacts with DELLA Proteins to Affect Flowering
Zhang et al. Plant Physiology (2018) 176:790-803.
doi:10.1104/pp.17.00657

シロイヌナズナWRKY転写因子は、ストレス応答や発生過程において重要な役割を演じている。最近の研究から、WRKYタンパク質が花成制御にも関与していることが報告されており、WRKY71はFLOWERING LOCUS T （FT ）やLEAFY （LFY ）の発現を直接活性化し、WRKY12とWRKY13は短日条件での花成時期制御において正反対に作用している。中国科学院 西双版納熱帯植物園のYu らは、花成時期を指標にして、WRKY T-DNA挿入変異体集団およびRNAi系統のスクリーニングを行なった。その結果、wrky75 変異体は対照と比較して花成が遅延することを見出した。また、恒常的にWRKY75 を発現させた系統は花成時期が早くなった。これらの結果から、WRKY75 は花成時期を制御していると考えられる。WRKY75 過剰発現系統ではFT の発現量が増加しており、wrky75 変異体では減少していた。WRKY75 プロモーター制御下でGUSを発現させてWRKY75 の発現組織を調査したところ、FT の発現部位と同じ維管束細胞での発現が観察された。よって、WRKY75 はFT の発現を活性化することで花成を促進しているものと思われる。FT 遺伝子プロモーター領域にはWRKYタンパク質が結合するW-boxエレメントと推定される配列がいくつか見られた。そして、WRKY75がFT 遺伝子プロモーター領域に結合し、FT の発現を正に制御していることが確認された。FT 過剰発現系統は花成時期が早くなるが、wrky75 変異を導入しても花成時期の変化は見られなかった。一方、WRKY75 過剰発現系統にft 変異を導入すると花成時期が遅延してft 変異体と同等になった。これらの結果から、WRKY75はFT の上流で作用し、FT に依存して花成時期を正に制御していることが示唆される。各種アッセイから、WRKY75はDELLAタンパク質と物理的に相互作用をすることが確認された。また、ベンサミアナタバコを用いた一過的発現解析から、DELLAタンパク質のGAIとRGL1がWRKY75の転写活性を抑制することが確認された。WRKY75 とRGL1 を過剰発現させた系統を用いたクロマチン免疫沈降（ChIP）-qPCR解析から、ジベレリン（GA）処理はWRKY75のFT 遺伝子プロモーターへの結合を高めることがわかった。よって、RGL1はWRKY75のターゲット遺伝子への結合能力を低下させていると思われる。WRKY75 過剰発現系統でRGL1 を過剰発現させる、もしくは機能獲得gai-1 変異を導入すると、花成促進効果が部分的に抑制された。GA処理はWRKY75 の発現を誘導する効果が有り、wrky75 変異体は野生型と比較してGA処理による花成に遅れが見られた。したがって、WRKY75 はGAによる花成時期制御に部分的に関与していることが示唆される。以上の結果から、WRKY75 はGAを介した花成時期制御において正の制御因子として機能していると推測される。

論文）エチレンによる根毛成長制御

Ethylene promotes root hair growth through coordinated EIN3/EIL1 and RHD6/RSL1 activity in Arabidopsis
Feng et al. PNAS (2017) 114(52):13834-13839.
doi: 10.1073/pnas.1711723115

エチレンは根毛の成長を促進する作用がある。シロイヌナズナにおいてエチレンシグナル伝達に関与しているETHYLENE INSENSITIVE 3（EIN3）およびそのホモログのEIN3-LIKE 1（EIL1）が機能喪失したein3 eil1 二重変異体の芽生えの根は、根毛が短く、エチレン前駆体の1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸（ACC）を添加しても根毛伸長促進が見られない。中国 南方科技大学のGuo らは、根毛形成に関与しているbHLH転写因子ROOT HAIR DEFECTIVE 6（RHD6）とそのホモログのRHD6-LIKE 1（RSL1）の機能喪失変異体rhd6 rsl1 の根は根毛が見られないが、ACC処理をすることで根毛が形成されることを見出した。また、ein3 eil1 二重変異体でRHD6 を過剰発現させることで根毛が伸長した。このことから、RHD6はEIN3/EIL1の下流もしくはEIN3/EIL1と並行して機能していると思われる。RHD6/RSL1はRSL クラスⅡ遺伝子のRSL2～5 の発現を正に制御している。rsl4 rsl2 二重変異体は根毛が形成されず、高濃度でACC処理をしても根毛形成が起こらないことから、RSL4/RSL2 はエチレンによる根毛成長誘導に関与していると考えられる。RSL クラスⅡ遺伝子のうち、RSL4 とRSL5 はエチレン処理によって転写産物量が増加し、RSL4 の増加はein3 eil1 二重変異体では完全に見られなくなった。RSL4 遺伝子のプロモーター領域にはEIN3結合部位（EBS、5'-ATGTAT-3'）が含まれており、この領域にEIN3が結合することが確認された。また、RSL4 の過剰発現はein3 eil1 二重変異体の根毛成長を回復させた。これらの結果から、RSL4 はEIN3の直接のターゲットであり、エチレンはEIN3/EIL1によるRSL4 の転写活性化を介して根毛伸長を促進していると考えられる。RHD6はRSL4 の直接活性化することが報告されているが、RHD6がRSL4 遺伝子プロモーター領域に結合する証拠は得られていない。各種試験から、EIN3とRHD6が相互作用をすることが確認された。また、ein3 eil1 rhd6 rsl1 四重変異体はRSL4 の発現が殆ど見られず、エチレン処理に対して応答しなかった。シロイヌナズナの根由来プロトプラストを用いたデュアルレポーターアッセイから、EIN3とRHD6を両方発現させたほうが単独で発現させた場合よりもRSL4 の転写を活性化させることがわかった。これらの結果から、EIN3とRHD6は互いに関連してRSL4 の転写を同時活性化していると考えられる。rhd6 rsl1 二重変異体、rsl4 rsl2 二重変異体ともに通常の条件では根毛形成の誘導が見られないが、ACC処理をすることで見られるようになり、rhd6 rsl1 二重変異体では誘導された根毛が部分的に伸長したが、rsl4 rsl2 二重変異体では根毛の伸長は見られなかった。ein3 eil1 rhd6 rsl1 四重変異体、ein3 eil1 rsl4 rsl2 四重変異体ではACC処理をしても根毛の誘導も伸長も起こらなかった。RNA-seq解析の結果、ein3 eil1 rhd6 rsl1 四重変異体と野生型の根では956遺伝子に発現量の差異が見られ、それらの大部分はein3 eil1 二重変異体、rhd6 rsl1 二重変異体と野生型との間よりも差異が大きくなっていった。エチレンによって発現が誘導される187遺伝子のうち、43遺伝子は根毛細胞で発現する遺伝子であり、エチレン処理したrhd6 rsl1 二重変異体でのこれらの遺伝子の発現量は無処理の野生型よりも低かった。このことから、根毛誘導が十分に活性化されるためにはEIN3/EIL1とRHD6/RSL1の両者の活性が必要であることが示唆される。根毛発現43遺伝子のうち、25遺伝子はRSL4によって発現が制御されていた。根毛形成は、オーキシンやサイトカイニンといった植物ホルモン、リンや窒素といった栄養素の欠乏によって誘導される。rhd6 rsl1 二重変異体は栄養素欠乏条件で根毛形成を示さず、ein3 eil1 二重変異体はいずれの条件に対して応答したが、根毛は野生型よりも短くなっていた。よって、これらの刺激に応答した根毛形成にはEIN3/EIL1とRHD6/RSL1の共同作用が重要であると考えられる。以上の結果から、根毛の誘導・伸長においてEIN3/EIL1とRHD6/RSL1は並行かつ相乗的に作用してRSL4 等の根毛誘導遺伝子の転写を誘導しており、エチレン存在下ではEIN3/EIL1の蓄積量が増加するために根毛誘導遺伝子の発現がさらに活性化すると考えられる。

論文）概日時計因子による塩ストレス制御

Arabidopsis EARLY FLOWERING3 increases salt tolerance by suppressing salt stress response pathways
Sakuraba et al. The Plant Journal (2017) 92:1106-1120.
doi: 10.1111/tpj.13747

シロイヌナズナEARLY FLOWERING3（ELF3）は花成の抑制に関与する概日時計因子として見出されたが、最近になってELF3が葉の老化抑制に関与していることが判った。このことから、韓国 ソウル大学校のPaek らは、ELF3は非生物ストレス応答に関与しているのではないかと考え、解析を行なった。その結果、塩ストレスに対してELF3 過剰発現個体（ELF3-OX ）は強い耐性を示し、elf3 変異体は塩ストレスによって壊死した。また、水耕栽培で塩ストレスを与えたところ、elf3 変異体は主根の成長が阻害されたが、ELF3-OX の主根はさほど影響を受けなかった。塩ストレスに対する感受性の変化は、ELF3と相互作用をするELF4、LUX ARRHYTHMO（LUX）といった概日時計因子やフィトクロムBの変異体では見られなかった。これらの結果から、ELF3は、概日時計因子とは独立して、葉や根の塩ストレス耐性を高めていると考えられる。ELF3は塩/乾燥ストレス耐性を高めるDREB2A 、RD29B 、COR15A の発現を増加させ、ストレス耐性を低下させるORE1/ANAC092 、ANAC016 、NAP/ANAC029 の発現を減少させることがわかった。また、クロロフィル異化酵素遺伝子群（CCEs ）、老化時に発現量が増加する遺伝子群（SAGs ）、老化時に発現量が減少する遺伝子群（SDGs ）の発現量を調査したところ、ELF3-OX ではCCEs やSAGs の発現量が減少し、SDGs の発現量が増加していた。これらの結果から、ELF3はストレス関連の転写調節ネットワークを広く調節することでストレス耐性を高めていると考えられる。シロイヌナズナGIGANTEA（GI）は日長花成誘導因子であるが、塩ストレス応答にも関与していることが知られており、gi 変異体は塩耐性を示し、GI-OX は塩ストレス感受性が高い。また、塩ストレス処理によってGIタンパク質量は急速に減少する。GIとELF3との関係を見たところ、ELF3-OX では塩ストレス処理によるGIタンパク質の減少が野生型よりも早く、elf3 変異体はGIタンパク質量が野生型よりも多くなっていた。しかしながら、塩ストレス処理によるGI mRNA量の減少については野生型との差は見られなかった。よって、ELF3は塩ストレス条件下でGIタンパク質の分解を促進していると考えられる。GIは、塩ストレス耐性の調節因子であるSOS2と相互作用をし、SOS2の塩ストレス耐性活性を低下させる。酵母two-hybridアッセイではELF3とSOS2との相互作用は観察されなかったが、in vivo プルダウンアッセイでは相互作用が観察され、この相互作用はgi 変異体では見られなかった。よって、ELF3は、おそらくGIを介して、間接的にSOS2による塩ストレス耐性に関与していると考えられる。ELF3はPHYTOCHROME INTERACTING FACTOR4 （PIF4 ）やPIF5 の転写の制御をしているとされている。PIF4、PIF5と塩ストレスとの関係を調査したところ、pif4 変異体の葉は塩ストレスに耐性を示し、PIF4 を薬剤誘導で発現させた芽生えは塩ストレスに対する感受性が高いことがわかった。また、塩ストレス処理によりELF3-OX ではPIF4 の発現が減少し、elf3 変異体では増加した。したがって、ELF3によるPIF4 mRNA量の制御は、塩ストレス応答において重要であると考えられる。各種アッセイから、ELF3はPIF4 遺伝子プロモーターに直接相互作用をしてPIF4 の転写を抑制していることが確認された。PIF4は、ANAC 遺伝子で非生物ストレス応答において重要な役割を担っているJUNGBRUNNEN1 （JUB1 ）/ANAC042 の転写を直接制御していることが知られている。塩ストレス処理後のJUB1 の発現は、pif4 変異体、ELF3-OX で増加し、PIF4-OX 、elf3 変異体では減少していた。よって、塩ストレス下でのJUB1 の発現はPIF4とELF3によって調節されていると考えられる。PIF4は、葉の老化の際に、老化促進に関与するNAC転写因子をコードするORE1/ANAC092 の転写を直接活性化している。ORE1は老化関連遺伝子SAG29 の発現を直接活性化しており、SAG29 は塩ストレス誘導因子としても作用している。ore1 変異体とsag29 変異体は、塩ストレス耐性が高くなっていた。また、塩ストレス処理によるORE1 、SAG29 の発現量の増加は、pif4 変異体、ELF3-OX で減少し、PIF4-OX 、elf3 変異体で増加していた。ORE1 遺伝子とSAG29 遺伝子のプロモーター領域にはPIF4が結合するG-boxモチーフが含まれており、PIF4がこのモチーフに結合してORE1 、SAG29 各プロモーターの転写活性を高めることが確認された。以上の結果から、概日時計因子ELF3は、PIF4 の転写調節とGIの転写後調節をすることで、塩ストレス応答を制御していると考えられる。

論文）光による気孔発生制御の分子機構

Light Inhibits COP1-Mediated Degradation of ICE Transcription Factors to Induce Stomatal Development in Arabidopsis
Lee et al. Plant Cell (2017) 29:2817-2830.
doi:10.1105/tpc.17.00371

シロイヌナズナbHLH型転写因子のInducer of CBF Expression（ICE）1/SCREAM（SCRM）とSCRM2は、気孔の発生過程全体を統御する因子として機能している。気孔の発生は、光、温度、湿度といった環境要因による影響を受けていることから、韓国 ソウル大学校のPark らは、光シグナルとICEによる気孔発生制御との関係を解析した。その結果、光はICE 遺伝子の転写には関与しないが、葉の背軸側表皮細胞でのICE1タンパク質の蓄積を促進することがわかった。光による気孔発生の誘導に対して抑制的に作用する光形態形成抑制因子のE3ユビキチンリガーゼCONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1（COP1）は細胞内でICE1と相互作用をして、ICE1をユビキチン化することが確認された。ICEタンパク質は、植物体を暗所で育成すると減少するが、プロテアソーム阻害剤のMG132処理をすることで減少が抑制された。また、cop1 変異体ではICEタンパク質の分解が抑制された。よって、COP1はICEタンパク質のユビキチン/プロテアソーム系を介した分解に関与していると考えられる。光はCOP1によるICEタンパク質の分解を阻害した。ICE1 を過剰発現させた芽生えは、弱光条件下で気孔数が野生型よりも増加した。ice1 scrm2 二重変異体の芽生え子葉では背軸側表皮細胞での気孔発生が見られず、この二重変異はcop1 変異体の暗所での恒常的気孔発生を抑制した。MAPKKキナーゼのYODA（YDA）はCOP1の下流で作用して気孔発生を抑制しており、yda 変異体は暗所において気孔が発生する。しかし、yda 変異体は明所で気孔数が増加し、ICE1タンパク質の蓄積の光応答性も見られた。よって、YDAは気孔発生においてICEによるシグナルとは独立して機能していることが示唆される。以上の結果から、暗所においてはCOP1がICEタンパク質をユビキチン/プロテアソーム系で分解することで、気孔の発生が阻害され、明所ではCOP1によるICEタンパク質の分解が抑制されるので気孔発生が誘導されると考えられる。

論文）アブシジン酸による種子発芽制御に関与する因子

Abscisic Acid Modulates Seed Germination via ABA INSENSITIVE5-Mediated PHOSPHATE1
Huang et al. Plant Physiology (2017) 175:1661-1668.
DOI:10.1104/pp.17.00164

シロイヌナズナPHOSPHATE1（PHO1）は、根からシュートへのリン酸（Pi）の輸送に関与している。PHO1 遺伝子は主に根の維管束系で発現しているが、公的マイクロアレイデータによると、PHO1 転写産物は種子に多く、浸漬によって増加することが示されている。このことから、中国農業大学のChen らは、PHO1はアブシジン酸（ABA）による種子発芽制御に関与しているのではないかと考え、解析を行なった。PHO1 転写産物量は、種子発芽初期に増加するが、ABAを添加することで減少した。pho1 変異体は、野生型種子と比べて、種子のリン含量が少なく、発芽率が低く、植物体の地上部が小さくなった。pho1 変異体の葉にPiをスプレーすることで植物体の成長が健全になり、この植物体の種子はリン含量や発芽率が野生型と同等になった。しかし、この種子はABAに対する感受性が高くなっており、ABA添加培地での発芽遅延、子葉の緑化率の低下が起こった。また、PHO1 を過剰発現させた系統はABAに対して非感受性となり、ABA存在下での発芽率が野生型よりも高くなった。これらの結果から、PHO1はABAを介した種子発芽や芽生えの初期成長に関与していることが示唆される。PHO1 遺伝子プロモーター領域には、ABAシグナル伝達の制御因子の１つであるbZIP型転写因子ABI5が結合するACGTモチーフが2つ含まれていた。ABI5 過剰発現系統ではPHO1 転写産物量が減少しており、abi5 変異体ではPHO1 発現量が増加していた。また、ABI5はPHO1 遺伝子プロモーターのACGTモチーフを含む領域に結合することが確認された。よって、ABI5はPHO1 遺伝子プロモーターに結合することでPHO1 の発現を負に制御していることが示唆される。abi5 変異体種子はABA存在下でも発芽するABA非感受性の表現型を示すが、abi5 pho1 二重変異体種子は、pho1 単独変異体種子と同様に、ABA感受性が高くなっていた。したがって、PHO1 はABAを介した種子発芽や芽生えの初期成長においてABI5 よりも上位に位置していると考えられる。以上の結果から、PHO1はアブシジン酸による発現制御を受けて種子発芽や芽生えの初期成長に関与してると考えられる。

論文）細胞質に局在するCOP1による胚軸伸長制御

COP1 mediates dark-specific degradation of microtubule-associated protein WDL3 in regulating Arabidopsis hypocotyl elongation
Lian et al. PNAS (2017) 114:12321-12326.
doi:10.1073/pnas.1708087114

中国農業大学のMao らは、以前に、シロイヌナズナ微小管関連タンパク質WAVE-DAMPENED 2（WVD2）/WVD2-LIKE（WDL）ファミリーのWDL3が胚軸の細胞の伸長制御に関与していることを明らかにした。WDL3タンパク質は明所においては豊富に存在するが、暗所では26Sプロテアソーム系によって分解される。しかしながら、この分解機構については明らかとなっていない。黄化芽生えの胚軸伸長では、E3ユビキチンリガーゼのCONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）が重要であることから、COP1が暗所でのWDL3の分解に関与しているのではないかと考え、解析を行なった。COP1とWDL3との相互作用を調査したところ、両者は暗所条件においてのみ相互作用をすることが判った。in vitro の実験から、COP1はWDL3のN末端領域と相互作用をし、ポリユビキチン化することが示された。COP1は暗所条件では核において機能するとされているが、最近の研究では核外にも一部局在することが示されている。WDL3は微小管関連タンパク質であり細胞質に局在するので、COP1とWDL3の相互作用が細胞内の何処で起こっているのかを調査したところ、両者は細胞質表層微小管において相互作用をしていることが確認された。暗所で育成した弱いcop1 変異体（cop1-6 ）芽生えは、明所で育成した芽生えのように胚軸が短くなる。cop1-6 変異体ではWDL3タンパク質は安定しており、暗所においても細胞表層微小管に結合した状態にあった。よって、暗所においてWDL3タンパク質量はCOP1により負に制御されている。WDL3 を過剰発現させた黄化cop1-6 変異体芽生えは胚軸伸長が抑制され、RNAiによってWDL3 の発現を減少させたcop1-6 変異体は胚軸が長くなった。胚軸表皮細胞の伸長は表層微小管の構成と関連しており、WDL3 RNAi cop1-6 黄化芽生え胚軸では表層微小管の平行配列は胚軸の伸長方向に対して横方向に配置していた。一方、cop1-6 変異体の胚軸細胞では、多くの細胞で表層微小管はランダム、斜め、もしくは縦方向に配置していた。cop1-6 変異体黄化芽生えの胚軸細胞は、WDL3 を過剰発現させることで短くなり、WDL3 を発現抑制することで長くなった。よって、WDL3はCOP1による胚軸伸長制御の下流で機能している因子であり、胚軸細胞の伸長阻害に関与していることが示唆される。以上の結果から、細胞質のCOP1は、黄化芽生え胚軸において微小管関連タンパク質をターゲットとして26Sプロテアソーム系で分解することで胚軸伸長を制御していると考えられる。