Laboratory ARA MASA のLab Note

植物観察、読んだ論文に関しての備忘録
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論文)サイトカイニンによる葉緑体遺伝子の発現制御

2017-03-24 21:42:55 | 読んだ論文備忘録

Opposite roles of the Arabidopsis cytokinin receptors AHK2 and AHK3 in the expression of plastid genes and genes for the plastid transcriptional machinery during senescence
Danilova et al. Plant Molecular Biology (2017) 93: 533-546.

DOI: 10.1007/s11103-016-0580-6

サイトカイニンは葉の老化を遅延させるが、その過程での葉緑体遺伝子の発現制御については明らかではない。ロシア科学アカデミー チミリャーゼフ植物生理学研究所のKudryakova らは、シロイヌナズナのサイトカイニン受容体であるヒスチジンキナーゼAHK2、AHK3、AHK4/CRE1の変異体を用いて葉の老化を解析した。3週目と7週目の第6葉について、クロロフィル含量、老化のマーカー遺伝子のSAG12 とクロロフィルa/b-結合タンパク質をコードするCAB2 の転写産物量を調査した。野生型、ahk3 変異体、ahk3 ahk4 二重変異体の7週目の植物の全クロロフィル含量は、3週目の植物と比べて大きく減少していたが、AHK2 が機能喪失した変異体(ahk2ahk2 ahk3ahk2 ahk4 )では減少の遅延が見られた。また、ahk2 変異体、ahk2 ahk3 二重変異体、ahk2 ahk4 二重変異体の7週目植物は、野生型、ahk3 変異体、ahk3 ahk4 二重変異体と比べてCAB2 転写産物量が多く、SAG12 転写産物量が少なくなっていた。さらに、AHK2 の機能喪失は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニット(RBCS)やPSⅡ集光性クロロフィルタンパク質のLHCB2.4をコードする遺伝子の転写産物量の減少が抑制されていた。ahk4 変異体は野生型と比較して幾分CAB2RBCS 転写産物量が増加し、SAG12 転写産物量が減少している程度で、野生型との差は他の変異体に比べて少なかった。したがって、AHK4はAHK2やAHK3と比較すると植物体の老化における役割は小さいと思われる。AHK2 の機能喪失は、抽だい、花成、長角果形成、種子成熟を遅延させた。したがって、AHK3が老化を遅延させるのに対して、AHK2は老化誘導に関与していることが示唆される。また、ahk2 変異体、ahk2 ahk3 二重変異体、ahk2 ahk4 二重変異体の7週目植物は、野生型よりもクロロフィル蛍光が高くなっていた。次に老化による葉緑体遺伝子の発現量変化を調査した。その結果、AHK2 が機能喪失した変異体の老化葉では多くの葉緑体遺伝子の転写産物量が野生型よりも増加しており、このことが葉の老化遅延の原因となっていると思われる。野生型植物の老化葉はサイトカイニン(trans-ゼアチン)処理によって葉緑体遺伝子の転写産物の蓄積量が増加するが、ahk2 変異体ではサイトカイニン処理による発現誘導効果が低下していた。また、ahk4 変異体は野生型とは異なるサイトカイニン応答を示した。サイトカイニン処理による葉緑体遺伝子の応答がサイトカイニン受容体の変異体で異なることは、それぞれの遺伝子は独立した制御を受けており、葉緑体ゲノム全体の転写が活性化されるのではないことを示唆している。そして、サイトカイニン受容体は老化葉の葉緑体へのシグナル伝達に特異性があり、サイトカイニンに応答した葉緑体遺伝子の転写活性化には1つのサイトカイニン受容体だけでは不十分であると考えられる。葉緑体での転写には核コードのT7ファージ型RNAポリメラーゼのRPOTpとRPOTmpが関与している。野生型植物の老化葉ではサイトカイニン処理によってRPOT 遺伝子の発現が誘導されるが、ahk3 変異体、ahk2 ahk3 二重変異体では発現誘導が低下していた。また、AHK2 が機能喪失した変異体はRPOTp 転写産物量が野生型よりも多かった。よって、個々のサイトカイニン受容体でRPOTpRPOTmp の発現制御が異なり、このことが葉緑体遺伝子の発現量の差異をもたらしていると考えられる。葉緑体遺伝子の転写制御は、核コードのσ因子も関与しており、シロイヌナズナでは6つの因子(SIG1-SIG6)が見出されている。葉緑体遺伝子の発現において、個々の因子は重複して機能しており、発現量は植物体の発達ステージや環境条件に依存している。サイトカイン受容体の変異体では、成熟した葉緑体で最も活性のあるSIG1をコードする転写産物が定常状態において野生型よりも多くなっていた。サイトカイニン処理をすることでSIG1 転写産物量は増加するが、ahk2 ahk3 変異体、ahk2 ahk4 変異体は定常状態での発現量が既に高いためにサイトカイニン処理による増加は僅かであった。サイトカイニン処理は、SIG2SIG3SIG4SIG6 の発現も誘導し、ahk2 変異体、ahk4 変異体、ahk2 ahk3 変異体は発現量の増加が大きくなっていた。定常状態でのSIG3SIG4SIG6 の発現は、AHK2 が機能喪失した変異体で高くなっていた。これらの結果から、老化葉でのσ因子遺伝子の発現におけるサイトカイニンの効果の差異は、核コードRNAポリメラーゼの発現の差異と共に、様々な葉緑体遺伝子の転写産物量蓄積量変化を制御していると考えられる。以上の結果から、老化葉での葉緑体遺伝子の発現は、個々のサイトカイニン受容体によって異なる制御を受けており、これは核コード遺伝子の発現量の変化に依存していると考えられる。

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学会)第64回日本生態学会大会(東京)

2017-03-15 22:24:51 | 学会参加

第64回日本生態学会大会(ESJ64)が、2017年3月14日(火)~18日(土)に早稲田大学早稲田キャンパスで開催された。シンポジウムや口頭発表の会場となった3号館は、旧3号館を改修して2014年に竣工した地下2階、地上14階、高さ67.84mの校舎。古い建物を活かしながら、内部には最新の設備が備わり、大会運営もスムーズに行われていた(ちょっとポスター会場の16号館が窮屈だったか)。このキャンパスは、大隈重信像、會津八一記念博物館、大隈庭園といった見所にもあるれており、散策に訪れる人も多く見られた。

第64回日本生態学会大会(ESJ64)が早稲田大学早稲田キャンパスで開催された

 

キャンパス内にある大隈重信像

 

会場となった3号館

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論文)糖シグナルを拮抗的に制御する2つのMYB転写因子

2017-03-13 22:12:38 | 読んだ論文備忘録

Two MYB-related transcription factors play opposite roles in sugar signaling in Arabidopsis
Chen et al. Plant Molecular Biology (2017) 93:299-311.

DOI: 10.1007/s11103-016-0562-8

植物では様々な遺伝子が糖シグナルによる発現制御を受けている。イネのR1/2-type MYB転写因子 OsMYBS1は、α-アミラーゼの糖による発現制御に関与していることが知られている。台湾 国立中央大学Lu らは、シロイヌナズナのOsMYBS1ホモログのMYBS1(At1g49010)とMYBS2(At5g08520)について糖シグナルとの関係を調査した。MYBS1とMYBS2はR-R-type MYB転写因子に分類される。MYBS1 は、芽生え、ロゼット葉、茎生葉、花芽、花、長角果で発現しており、MYBS2 は植物体全体で恒常的に発現していた。また、MYBS1、MYBS2は共に核に局在していた。OsMYBS1はイネαAmy3 遺伝子プロモーター領域内にある糖応答エレメントのTA-box(TATCCA)に結合して転写を活性化する。TA-boxを含んだ合成プロモーターによるレポーター遺伝子(Luc )の発現解析から、MYBS1、MYBS2ともにTA-boxを含むプロモーターを活性化させることが確認された。種子を1%グルコースもしくは1%マンニトールを含む培地で発芽させ、遺伝子発現量を比較したところ、MYBS1MYBS2 ともにグルコース添加培地での発現量がマンニトール培地での発現量よりも高くなっていた。したがって、MYBS1MYBS2 の発現は糖による制御を受けていると考えられる。T-DNA挿入mybs1 およびmybs2 変異体は、通常生育条件では表現型が野生型と同等であった。そこで、これらの変異体の糖応答性を見たところ、4%グルコース添加培地での発芽率がmybs1 変異体は野生型よりも低くなり、芽生えの成長遅延も見られたが、mybs2 変異体の発芽率は野生型よりも高くなっていた。そして、mybs1 mybs2 二重変異体の発芽率は野生型と同等であった。これらの結果から、mybs1 変異体はグルコースに対する感受性が高く、mybs2 変異体は感受性が低いことが示唆され、MYBS1とMYBS2は糖シグナル伝達経路において対立した機能があると考えられる。糖は光合成、炭素代謝、窒素代謝、二次代謝に関与する様々な遺伝子の転写を制御している。4%グルコース培地で育成したmybs1 変異体芽生えは、ヘキソキナーゼ1をコードするHXK1 、ADP-Glcピロフォスフォリラーゼ大サブユニットをコードするAPL3 、カルコンシンターゼをコードするCHS 、β-アミラーゼをコードするBAMY3 スクロースシンターゼ1をコードするSUS1 の発現量が野生型よりも高く、mybs2 変異体ではこれらの遺伝子の発現量が野生型よりも低くなっていた。また、クロロフィルa/b結合タンパク質をコードするCAB1 、アスパラギン合成酵素1をコードするASN1 の発現量はmybs1 変異体で低く、mybs2 変異体で高くなっていた。グルコースシグナルはアブシジン酸(ABA)シグナルと関連していることが知られている。そこで、ABA添加培地での発芽率を見たところ、mybs1 変異体の発芽率は野生型よりも低く、mybs2 変異体は高くなっており、両変異体はABAに対する応答性が変化していた。野生型植物の4%グルコース添加培地での発芽遅延は、ABA合成阻害剤のフルリドンを添加することによって回復し、mybs1 変異体でも回復が見られた。したがって、mybs1 変異体はグルコース高感受性はABAの過剰生産による可能性がある。一方、mybs2 変異体ではフルリドン添加による高グルコース濃度培地での発芽率の変化は見られなかった。4%グルコース添加培地で発芽させたmybs1 変異体芽生えは、ABA生合成酵素をコードするABA1NCED3AAO3 の発現量が野生型よりも高くなっており、mybs2 変異体では低くなっていた。したがって、グルコースが誘導するABA生合成において、MYBS1はABA1NCED3AAO3 の発現を負に制御し、MYBS2は正に制御していることが示唆される。また、ABAによって発現誘導されABAシグナル伝達に関与するABI3ABI4ABI5 の発現量もmybs1 変異体で高く、mybs2 変異体で低くなっていた。以上の結果から、MYBS1とMYBS2はシロイヌナズナの種子発芽や芽生えの成長過程におけるグルコースおよびABAシグナル伝達において拮抗的に作用し、MYBS1は負の制御因子、MYBS2は正の制御因子として機能していると考えられる。

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論文)傷口からのシュート再生

2017-03-09 18:50:36 | 読んだ論文備忘録

WIND1 Promotes Shoot Regeneration through Transcriptional Activation of ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1 in Arabidopsis
Iwase et al. Plant Cell (2017) 29:54-69.

doi:10.1105/tpc.16.00623

植物の器官再生は、2つの植物ホルモン、オーキシンとサイトカイニンのバランスによって制御されており、一般的にオーキシン量が多いと根を再生し、サイトカイニン量が多いとシュートを再生する。近年、理化学研究所 環境資源科学研究センター杉本らは、傷ストレスはシュート再生を誘導する要因となっており、AP2/ERF型転写因子のWOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1(WIND1)がこの誘導に関与していることを明らかにした。そして、WIND1 を過剰発現させたシロイヌナズナカルスでは、シュート再生を促進することが知られているAP2/ERF型転写因子のENHANCER OF SHOOT REGENERATION 1ESR1 )の発現量が増加していることを見出した。そこで、WIND1とESR1との関係について調査した。切り葉に傷ストレスを与えるとWIND1 の発現量が30分以内に増加し始め、1時間後には最大となった。ESR1 の発現量も30分以内に増加か始まり、3時間後には最大となった。しかしながら、WIND1にリプレッションドメイン(SRDX)を付加したドミナントリプレッサーWIND1-SRDX を発現させた植物体を用いた場合にはESR1 の傷ストレスによる発現活性化は見られなかった。したがって、WIND1はESR1 の発現活性化に関与していることが示唆される。ESR1 プロモーター制御下でGUS を発現するコンストラクトを導入した植物体では、無傷の状態ではGUS活性は検出されなかったが、傷をつけることによって傷口で局所的にGUS活性が誘導された。また、WIND1-SRDX 発現個体では傷口でのGUS活性誘導は起こらなかった。葉柄切片で詳細に活性部位を見ると、木部柔組織や前形成層といった維管束で発現が見られ、細胞分裂によってカルス化すると推測される葉肉細胞においても活性が見られた。傷口ではオーキシンが蓄積することが知られているが、オーキシン輸送阻害剤N-1-ナフチルフタラミン酸(NPA)を処理をしても活性に変化は見られなかった。よって、傷口でのESR1 の活性化に局所的なオーキシン輸送は関与していないと考えられる。 ESR1タンパク質は傷口近傍の細胞の核内に局在していた。クロマチン免疫沈降(ChIP)-qPCR解析から、WIND1はESR1 遺伝子プロモーター領域に直接結合することが確認され、ルシフェラーゼレポーター試験からWIND1はESR1 の発現を活性化することがわかった。また、プロモーターバッシング試験からWIND1によるESR1 の発現誘導には翻訳開始点から上流150 bpまでが重要であることがわかった。この領域には、タバコの傷ストレス遺伝子発現誘導に関与するとされるVWERモチーフに似た配列が2つあり、このモチーフに変異を加えることでプロモーター活性が低下した。これらの結果から、WIND1はESR1 遺伝子プロモーター領域のVWRE-likeモチーフに直接結合して発現を活性化していると考えられる。WIND1は傷口でのカルス形成に関与している。ESR1 の変異体やESR1-SRDX ドミナントリプレッサーを発現させた系統はカルス形成が抑制された。また、ESR1 を異所的に過剰発現させた系統はカルス形成が促進された。よって、ESR1も傷口でのカルス形成に関与していると考えらる。WIND1-SRDX 発現個体でESR1 を異所的に発現させると、WIND1-SRDX 発現個体のカルス形成抑制が打ち消され、カルス形成が野生型と同等になった。esr1 変異体でWIND1 を過剰発現させると、WIND1 過剰発現によるカルス形成促進が幾分抑制された。よって、ESR1はWIND1の下流で機能して傷口でのカルス形成を促進していると考えられる。WIND1は、B-タイプ シロイヌナズナレスポンスレギュレーター(ARR)によるサイトカイニンシグナル伝達系を介してカルス形成を促進している。B-タイプARRシグナル伝達が欠失したarr1 arr12 二重変異体では傷ストレスによるESR1 の発現誘導が見られないことから、ESR1はB-タイプARRによるサイトカイニンシグナルの下流において機能していると考えられる。野生型シロイヌナズナの組織片は植物ホルモンを含まないMS培地で培養するとカルス形成し、しばしば根を再生する。ESR1 を過剰発現させた系統では、様々な器官由来の組織片の傷口からシュートが再生した。よって、ESR1は傷口でのシュート再生を促進することが示唆される。野生型植物の根切片を、オーキシンとサイトカイニンを添加したカルス誘導培地(CIM)で培養した後にサイトカイニンを多く含むシュート誘導培地(SIM)に移植するとシュートが再生されるが、esr1 変異体やESR1-SRDX 個体の根切片ではシュート再生が殆ど見られなかった。また、ESR1 を過剰発現させた根切片はシュート再生能力が野生型よりも高くなっていた。一方、esr1 変異体、ESR1-SRDX 個体、ESR1 過剰発現個体のCIMでのカルス形成は野生型と同等であり、ESR1はホルモンによって誘導されるカルス形成には関与していないと考えられる。ESR1 の発現はサイトカイニンとオーキシンを同時に与えることで活性化されたが、それぞれを単独で与えた場合には活性化されなかった。よって、サイトカイニンとオーキシンはESR1 の発現活性化において相乗的に作用していると考えられる。根切片をCIMで4日間培養するとESR1 の発現が活性化され、続いてSIMで培養することで発現量はさらに3倍増加した。SIMでの培養で発現量が増加するシュート再生関連遺伝子のうち、ESR2CUP SHAPED COTYLEDON1CUC1 )、WUSCHELWUS )、SHOOT MERISTEMLESSSTM )、RELATED TO AP2 6LRAP2.6L )はESR1による発現制御を受けていることが確認された。WIND1-SRDX 個体やESR1-SRDX 個体の切り葉を植物ホルモンを含まないMS培地で培養した際の傷口からの根の再生は野生型と同等であることから、WIND1-ESR1経路は根の再生には関与していないと考えられる。以上の結果から、WIND1は直接ESR1 の発現を活性化することで傷口からのカルス形成やその後のシュート再生を促進していると考えられる。


理化学研究所のプレスリリース

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論文)Aux/IAAタンパク質による非生物ストレス耐性

2017-03-02 05:07:53 | 読んだ論文備忘録

Plant Stress Tolerance Requires Auxin-Sensitive Aux/IAA Transcriptional Repressors
Shani et al. Current Biology (2017) 27:437-444.

DOI: 10.1016/j.cub.2016.12.016

Aux/IAAタンパク質はオーキシン応答の抑制に関与する因子で、植物の様々な生理・成長過程を制御している。米国 カリフォルニア大学サンディエゴ校Estelle らは、Aux/IAA 遺伝子の発現制御機構を解明するために、シロイヌナズナの15のAux/IAA 遺伝子のプロモーター領域をベイトに用いた酵母one-hybrid(Y1H)法によりシロイヌナズナの1956の転写因子をスクリーニングし、38の転写因子ファミリーの173の転写因子を見出した。このうち83の転写因子は幾つかのIAA プロモーターに結合し、90は1種類のIAA プロモーターとのみ相互作用を示した。また、大部分のIAA プロモーターは特定の転写因子ファミリーとの特異性を示した。興味深いことに、これまでオーキシンシグナルとの関連性が指摘されていなかったDREB/CBFファミリー転写因子が、多くのIAA プロモーターと相互作用を示した。DREB/CBF 遺伝子ファミリーはシロイヌナズナに56あり、A1~A6までのサブファミリーに分かれている。サブファミリーA2、A3、A6のDREB/CBFは多数のIAA プロモーターと相互作用を示したが、サブファミリーA1、A4、A5はIAA3 プロモーターとIAA5 プロモーターとの間で特異的な相互作用を示した。DREB/CBFは、乾燥、低温、高塩濃度といったストレスに応答する遺伝子の発現を制御している。そこで、非生物ストレスがオーキシン応答に影響しているかをDR5:3XVENUS-NLS レポーターを用いて調査した。その結果、芽生えを乾燥させたり、ポリエチレングリコール(PEG)を含む培地で成長させることでオーキシン応答が抑制されることがわかった。また、PEG処理はオーキシンに応答した胚軸伸長を強く阻害した。乾燥処理30分後の遺伝子発現を詳細に解析したところ、IAA5 プロモーターに結合する6つのDREB/CBF 遺伝子の発現が強く誘導され、オーキシンコレセプター遺伝子のうちTIR1AFB2AFB4 の発現量に変化は見られなかったが、AFB3AFB1 の発現量は減少した。また、幾つかのオーキシン生合成遺伝子と多くのAux/IAA 遺伝子は発現量が変化していた。乾燥処理で発現が最も大きく誘導されるIAA5 と本遺伝子と関連性の高いIAA19 のプロモーターに6種類のDREB/CBF(CBF1、CBF2、DREB2A、DREB2B、At1G19210、At2G44940)が相互作用をすることが確認された。DREB/CBFはDRE/CRTエレメントに結合し、IAA2IAA5IAA6IAA9IAA19 のプロモーター領域にはDREエレメントが存在していた。Y1Hアッセイの結果、DREB/CBFはDREエレメントに変異を加えたIAA5 プロモーターへの結合が劇的に減少することがわかった。また、IAA5 プロモーター制御下でLUCを発現するコンストラクトを導入した植物は乾燥処理によってLUC活性が増加したが、DREエレメントに変異の入ったIAA5 プロモーターのコンストラクトでは、基底状態のLUC活性が低く、乾燥処理による誘導も見られなかった。クロマチン免疫沈降(ChIP)試験から、CBF1とDREB2AはIAA5 およびIAA19 のプロモーター領域と相互作用をすることが確認された。薬剤によりDREB2A の発現を誘導する系を用いた試験から、IAA5IAA19 はDREB2Aによって発現誘導されることが確認された。DREBによる転写を抑制することが知られているC末端側を欠いたCBF2 を過剰発現させた系統は、ストレスによるIAA5IAA19 の発現誘導が抑制されていた。また、dreb2a dreb2b 二重変異体は乾燥処理によるIAA5IAA19 転写産物蓄積が抑制されていた。これらの結果から、DREB/CBFはIAA5IAA19 のストレスによる発現誘導に必要であることが示唆される。iaa5iaa6iaa19 の各変異体は、通常の生育条件では表現型に変化は見られないが、乾燥ストレス処理に対して感受性が高くなっていた。したがって、IAA5IAA6IAA19 はストレス耐性にとって重要であると考えられる。

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