論文）TIME FOR COFFEEによる根の分裂組織の制御

TIME FOR COFFEE controls root meristem size by changes in auxin accumulation in Arabidopsis
Hong et al.  Journal of Experimental Botany (2014) 65:275-286.
doi:10.1093/jxb/ert374

TIME FOR COFFEE（TIC）は概日時計の調節因子として機能しているが、MYC2タンパク質の蓄積を抑制してジャスモン酸（JA）シグナルを負に制御することが報告されており、シロイヌナズナtic 変異体芽生えはJAによる根の伸長阻害に対して高感受性を示す。しかしながら、JAを添加していない条件で発芽10日目のtic-2 変異体の根の長さは野生型と同等であり、TIC が根の成長に対してどのように関与しているかは明らかではない。中国 武漢大学のLu らは、シロイヌナズナtic-2 変異体芽生えの1次根の成長を野生型と比較し、発芽から3、4日目ではtic-2 変異体の1次根は野生型よりも短いが、その後は伸長阻害が見られないことを見出した。したがって、TIC は根の初期成長に関与していると考えられる。tic-2 変異体の根は分裂領域の長さと細胞数が野生型よりも減少しており、TIC は分裂領域の細胞数を制御することで根の伸長に影響していることが示唆される。興味深いことに、tic-2 変異体の根の伸長領域の長さは野生型と同等であり、成熟領域の細胞は野生型よりも大きいことがわかった。TIC は概日時計の調節因子なので、日長を変えることで分裂領域の長さや細胞数に変化が見られるかを調査したが、明確な違いは見られなかった。根の伸長量は日変動するが、tic-2 変異体の根の伸長の日変動は野生型と同じであった。また、tic-2 変異体の分裂領域の長さと細胞数は明方においても夕方においても野生型よりも少なくなっていた。tic-2 変異体は分裂組織の細胞分裂能が明方も夕方も野生型よりも低下していた。tic-2 変異体の中には、静止中心細胞やコルメラ細胞の数が増えたり、新たな幹細胞列の見られる個体もあり、TIC は幹細胞周辺のポテンシャルにも関与していると考えられる。TIC は調査した全ての組織で恒常的に発現しており、特に花での発現量が高くなっていた。根においてTIC は分裂組織で高い発現が見られ、TIC が根の分裂組織に作用していることと一致している。オーキシンは根の分裂組織の維持にとって重要であり、オーキシン量の低下した変異体は分裂組織が小さくなる。tic-2 変異体でオーキシン応答DR5::GFP マーカーを発現させたところ、明方も夕方も蛍光強度が野生型よりも低いことがわかった。また、tic-2 変異体の根の内生IAA量は明方も夕方も野生型よりも低くなっていた。よって、オーキシン量の減少がtic-2 変異体の分裂組織の大きさを変化させていることが示唆される。そこで、tic-2 変異体にIAAを与えてみたところ、分裂組織の大きさや細胞数が増加した。野生型植物において、オーキシン添加によるTIC 発現量の変化は見られなかった。標識したIAAを用いた試験から、tic-2 変異体では明方も夕方も根へのオーキシン極性移動量が減少していることがわかった。したがって、tic-2 変異体の根のオーキシン量の低下は求頂的なオーキシン輸送量の低下によるものと考えられる。地上部の茎頂や若い葉で合成されたオーキシンは根の成長にとって重要であることから、芽生えの地上部を切除して根の成長を見たところ、野生型植物では分裂組織の長さや細胞数が減少してtic-2 変異体の根のようになったが、tic-2 変異体では大きな変化は見られなかった。また、tic-2 変異体はオーキシン生合成遺伝子の根での発現量が野生型よりも低く、オーキシン生合成能力もtic-2 変異体の表現型に影響していると考えられる。根の分裂組織の大きさは、PIN1 、PIN2 、PIN3 、PIN7 によって制御されており、tic-2 変異体ではこれらの遺伝子の転写産物量が野生型よりも大きく減少していた。したがって、PIN 遺伝子の発現量の低下がtic-2 変異体のオーキシン輸送の低下の原因となっていると考えられる。根の幹細胞の維持・制御にはSCARECROW （SCR ）/SHORT-ROOT （SHR ）とPLETHORA （PLT ）の2種類の経路が関与している。tic-2 変異体ではSCR /SHR の発現量に変化は見られなかったが、PLT1 、PLT2 の発現量が低下していた。よって、オーキシン量の低下によるPLT1 /2 の発現量の低下がtic-2 変異体の分裂組織の大きさに影響を及ぼしていると考えられる。JAはMYC2を介して根の成長を阻害するので、tic-2 変異体では根分裂組織でのMYC2蓄積量が増加しているために根の成長が抑制されているとも考えられる。しかし、tic-2 myc2-1 二重変異体の根分裂組織はtic-2 変異体と同様に長さが短く、myc2-1 変異体の分裂組織の長さは野生型と同等であった。よって、tic-2 変異体の根分裂組織が短いことにMYC2 は関与していないと考えられる。これらの変異体にJA処理をして分裂組織の長さを比較すると、myc2-1 変異体は野生型よりも長く、過去知見が示すように、JAを介した分裂組織の長さの制御にはMYC2 が関与していることが示された。tic-2 myc2-1 二重変異体もJAの根に対する感受性が低下していたが、tic-2 変異体はJAに対する感受性が高くなっていた。これは、tic-2 変異体ではMYC2タンパク質が蓄積していることによると考えられる。以上の結果から、tic-2 変異体の根の分裂組織の長さや細胞数の減少は、PIN の発現量低下によるオーキシン蓄積量の減少によってPLT1 /2 発現量が低下して幹細胞の活性が低下していることが原因であり、MYC2 を介したジャスモン酸シグナルはおそらく関与していないと考えられる。

論文）ストレスによる花成誘導機構

Stress-induced early flowering is mediated by miR169 in Arabidopsis thaliana
Xu et al.  J. Exp. Bot. (2014) 65:89-101.
doi: 10.1093/jxb/ert353

マイクロRNA（miRNA）のmiR169ファミリーはシロイヌナズナに14遺伝子存在しており、乾燥、低温、高塩濃度、窒素欠乏、UB-B照射といった非生物ストレスによって発現量が増加する。miR169のターゲットは、NF-Y転写因子のサブユニットの1つであるAtNF-YA 遺伝子ファミリーであることが知られている。NF-YはNF-YA、NF-YB、NF-YCからなるヘテロ三量体のCCAAT-結合転写因子で、様々な遺伝子の転写を制御している。シロイヌナズナにはNF-YAサブユニットをコードする遺伝子が10遺伝子存在している。中国農業科学院のWang らは、miR169d の前駆体転写産物を35Sプロモーター制御下で過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作出し、miR169のストレス応答における機能の解析を行なった。miR169d 発現個体と野生型植物の花成時期を比較したところ、長日条件下で野生型植物は平均11枚のロゼット葉をつけたところで花成したのに対して、miR169d 発現個体は平均7枚のロゼット葉で花成した。短日条件下では、野生型植物の花成は長日条件よりも遅れ、開花までに平均22枚のロゼット葉をつけたが、miR169d 発現個体は長日条件と同じ平均7枚のロゼット葉で花成した。したがって、miR169d の過剰発現は花成を促進し、この促進効果は日長に影響されない。miR169d 過剰発現個体では、miR169dのターゲットとなりうるAtNF-YA 遺伝子の転写産物量が減少しており、特にAtNF-YA2 、AtNF-YA8 、AtNF-YA10 の転写産物が大きく減少していた。そこで、AtNF-YA2 もしくはmiR169dのターゲット配列を改変して分解を受けなくなったAtNF-YA2m を35Sプロモーター制御下で過剰発現する形質転換シロイヌナズナを作出して花成を観察した。長日条件下でAtNF-YA2 発現個体は平均12枚のロゼット葉をつけて花成し、野生型よりも花成がわずかに遅れたが、AtNF-YA2m 発現個体は平均14枚のロゼット葉をつけて花成し、野生型植物やAtNF-YA2 発現個体よりも花成が遅れた。短日条件下では、AtNF-YA2 発現個体は平均27枚、AtNF-YA2m 発現個体は平均33枚のロゼット葉で花成し、野生型よりも花成が遅れた。AtNF-YA2 発現個体でmiR169d を過剰発現させると、花成時期はmiR169d 発現個体と同程度になった。したがって、AtN-YA2 の発現量増加は花成遅延を起こし、miR169dを介したAtNF-YA ファミリー遺伝子の制御は花成時期の制御に関与していることが示唆される。miR169d 発現個体ではAtNF-YA2 の転写産物量が減少しており、miR169dは直接AtNF-YA2 をサイレンシングさせていると考えられる。miR169d 発現個体では、花成を抑制するFLOWERING LOCUS C （FLC ）の転写産物量が減少しており、FLCによって発現が抑制されるFLOWERING LOCUS T （FT ）やLEAFY （LFY ）の転写産物量が増加していた。一方、AtNF-YA2 発現個体やAtNF-YA2m 発現個体ではFLC の発現量が増加しており、AtNF-YA2m 発現個体ではFT やLFY の発現量の減少も観察された。以上の結果から、miR169dはAtNF-YA2 をターゲットとして花成を制御し、この制御によってFLC の発現が抑制されて花成を促進するFT やLFY の発現が起こるものと考えられる。NF-YAタンパク質はCCAAT boxに結合し、FLC 遺伝子のプロモーター領域や第1イントロンには複数のCCAATモチーフが存在する。クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイやゲルシフトアッセイの結果、NF-YA2タンパク質はFCL 遺伝子のCCAATモチーフに結合することが確認された。よって、NF-YA2はFLC のプロモーターや第1イントロンと物理的相互作用をすることでFLC の発現を制御していると考えられる。NF-YA2タンパク質はFLC のパラログであるMADS AFFECTING FLOWERING 1 （MAF1 ）－MAF5 遺伝子とは相互作用を示さなかった。環境ストレスとして低温処理をしたmiR169d 発現個体では花成時期に変化が見られなかった。これは、低温処理によってFLC の発現量が十分に低下していたためであると考えられる。野生型植物とAtNF-YA2 発現個体は日長条件に関係なく低温処理によって花成が促進されたが、AtNF-YA2m 発現個体は短日条件での低温処理で花成促進が起こらなかった。これは、AtNF-YA2m 転写産物がmiR169のターゲットとならないために低温処理に関係なく十分量蓄積していたことによると考えられる。花成に対して促進的に作用するCONSTANS （CO ）、抑制的に作用するSHORT VEGETATIVE PHASE （SVP ）やマイクロRNA miR156 は、野生型と形質転換体で発現量に差が見られないことから、miR169を介した花成促進にこれらの因子は関与していないと考えられる。AtNF-YA2 発現個体やAtNF-YA2m 発現個体は、野生型植物と同様に、ジベレリン処理によって花成が促進された。よって、miR169はジベレリンを介した花成促進経路には関与していないと考えられる。以上の結果から、miR169/AtNF-YAは、花成抑制因子FLC の発現を制御することで、ストレスに応答した花成促進を引き起こしており、この経路は他の花成制御経路とは独立して機能していると考えられる。

論文）種子の大きさと発芽光要求性

Campanulaceae: a family with small seeds that require light for germination
Koutsovoulou et al.  Ann Bot (2014) 113:135-143.
doi: 10.1093/aob/mct250

種子の光に応答した発芽の制御は、芽生えの生存にとって重要である。発芽に光を必要とする種子は小型のものが多く、種子の光応答性と種子の大きさは、種子が土の表面近くあるときに発芽するよう共進化してきたことが示唆される。一方、系統学的に光による発芽誘導と種子の大きさには関連が無いとの指摘もある。ギリシャ アテネ大学のThanos らは、キキョウ科の131の分類群の種子について発芽に対する光の効果を調査した。キキョウ科は双子葉植物の科で、大部分が草本、一部はつる性の、85属約2300種からなり、世界的に広く分布する。使用したキキョウ科の種子のサイズは5～1060 μgの範囲にあった。分類群はは27属と3つのサブファミリーに別れ、5大陸（アフリカ：4分類群、アメリカ：26分類群、アジア：13分類群、ヨーロッパ：75分類群、オセアニア：13分類群）の様々な生息環境に自生するものを用いた。調査した131の分類群全ての種子において、光照射（1日に8時間もしくは12時間）した種子は連続暗黒下の種子よりも高い発芽率を示したが、発芽に対する光の必要度は種子のサイズが大きくなるにつれて低下した。また、サイズの大きい種子は一定温度条件の連続暗黒下よりも1日の温度条件を可変した連続暗黒下で高い発芽率を示した。種子発芽に対して促進的に作用するジベレリン処理をすると、試験した10種において光の代替として作用し、最終的には光照射よりも高い発芽率を示した。一方、栄養源として硝酸を与えた場合は、暗黒下での発芽が促進されたのは3種のみであった。以上の結果から、キキョウ科の多くの種は発芽に光を必要とし、ジベレリンは光の代替となること、硝酸も一部の種では代替となることがわかった。発芽における光の効果は大きい種子の種よりも小さい種子の種において強く表れ、小さい種子は地中深くに埋もれている際には発芽が抑制されると考えられる。また、大きい種子は地中深くに埋もれていても温度変化によって発芽しうることが示唆される。

論文）ストリゴラクトンシグナルの抑制因子

DWARF 53 acts as a repressor of strigolactone signalling in rice
Jiang et al.  Nature (2013) 504:401-405.
doi:10.1038/nature12870

D14-SCF^D3-dependent degradation of D53 regulates strigolactone signalling
Zhou et al.  Nature (2013) 504:406-410.
doi:10.1038/nature12878

News & Views
Plant biology: Witchcraft and destruction
Steven M. Smith   Nature (2013) 504:384-385.

ストリゴラクトンのシグナル伝達にはF-boxタンパク質（イネ：DWARF3、シロイヌナズナ：MORE AXILLARY GROWTH2、エンドウ：RAMOSUS4）が関与しており、このことから、ストリゴラクトンシグナル伝達にはSCF複合体によってユビキチン化、分解される抑制因子が関与していることが推測されていたが、その実体は明らかとなっていなかった。今回、中国の2つのグループからイネDWARF3の基質となるストリゴラクトンシグナル抑制因子の論文が発表された。

中国科学院 遺伝・発育生物学研究所のLi ら［Nature (2013) 504:401-405.］は、ストリゴラクトン（SL）の生合成経路やシグナル伝達経路を解析するために、イネの多分けつわい化変異体に着目し、その中から優性のe9 変異体（親品種：日本晴）について詳細な解析を行なった。e9 変異体は、合成ストリゴラクトンGR24の添加に対して耐性を示し、D10 の発現量が高く、内生SL（epi -5DS）量が野生型よりも30％程度高い表現型を示す。よって、e9 はストリゴラクトンのシグナル伝達に関与していると考えられる。マップベースクローニングの結果、e9 はLOC_Os11g01330の第3エクソンに15塩基の欠損があり、813-817番目のアミノ酸（Gly-Lys-Thr-Gly-Ile）の欠損と812番目のアミノ酸の置換（R→T）を起こすことがわかった。この変異はイネd53 変異体と全く同じ変異であり、以降、e9 をd53 と呼ぶ。d53 由来のLOC_Os11g01330を野生型イネに導入すると、全ての系統でd53 と同じ表現型を示した。D53 遺伝子は、Double Clp-N motif-containing P-loop nucleoside triphosphate hydrolase スーパーファミリーに属するタンパク質をコードしており、イネLOC_Os12g01360（D53-like）と96.5％の相同性が見られた。また、最近シロイヌナズナにおいて同定され、HEAT SHOCK PROTEIN 101（HSP101）とも類似性が見られる、D53-like（SUPPRESSOR OF MORE AXILLARY GROWTH2 1-LIKE(SMXL)）サブファミリーと36-41％の類似性があった。D53タンパク質は、エチレン応答性エレメント結合因子関連両親媒性抑圧（EAR）モチーフにと推定される配列をを3つ含んでおり、このモチーフは幾つかの植物ホルモンシグナル伝達経路においてコリプレッサーとして機能しているTOPLESS（TPL）との相互作用に関与していることが指摘されている。D53 は主に芽生えのシュート基部、若い葉、腋芽、若い円錐花序で発現していた。D53タンパク質およびd53変異型タンパク質は共に核に局在しており、変異型タンパク質は細胞内局在に変化は見られなかった。野生型植物をGR24処理するとD53 転写産物量が増加し、SL生合成やシグナル伝達が欠損したd 変異体類ではD53 転写産物量が減少していた。よって、D53 の発現はSLシグナルの負のフィードバック制御に関与していると考えられる。一方、D53タンパク質量はd53 変異体を含む全てのd 変異体類で野生型よりも多くなっていた。野生型植物をGR24処理するとD53タンパク質量は速やかに減少したが、変異型d53タンパク質は減少しなかった。GR24処理によるD53タンパク質の減少はプロテアソーム阻害剤MG132処理によって抑制された。よって、D53タンパク質の分解はユビキチン化が関与していると考えられる。GR24処理によってD53タンパク質はポリユビキチン化されたが、d53タンパク質はされなかった。したがって、D53タンパク質はGR24に応答してポリユビキチン化され、ユビキチン-プロテアソーム系を介して分解されると考えられる。以上の結果から、D53はSLシグナル伝達の抑制因子として機能し、d53 変異体ではd53タンパク質がSLによる分解に対して非感受性であるため優性の表現型を示すと考えられる。d3 変異体およびd14 変異体でD53 を過剰発現させてもそれぞれの変異体の表現型に殆ど変化は見られなかったが、D53 の発現を抑制するとそれぞれの変異体の分けつ数が減少した。また、d3 変異体およびd14 変異体ではD53タンパク質の分解がGR24を添加しても起こらなかった。よって、D53 はD3 およびD14 の下流において作用していると考えられる。さらにD53タンパク質のユビキチン化はd3 変異体およびd14 変異体では起こらなかった。したがって、SLの誘導するD53タンパク質の分解は、D3およびD14の機能に依存していることが示唆される。D53タンパク質はD14タンパク質と相互作用をすることが確認され、変異型d53タンパク質もD14タンパク質と相互作用を示した。よって、d53 変異はユビキチン化に必須な部位の変異であり、D14との相互作用には関与していないと考えられる。D53とD14の相互作用は、GR24の添加によって、その濃度に応じて強くなった。D14のヒドロラーゼ活性に関与しているSer-His-Aspの3アミノ酸に変異が入ると、SLの誘導するD53タンパク質の分解が弱まり、D53とD14の相互作用も弱くなった。よって、D14によるSLの受容はSLの誘導するD53タンパク質の分解に必須であると考えられる。D14とD3は相互作用をし、GR24はこの相互作用を強めた。また、D14の3アミノ酸の変異はGR24の誘導するD3とD14の相互作用を弱めた。D53はD3とも相互作用をすることから、D53はD3の直接のターゲットであると考えられ、SLを介したD14とD3およびD53との相互作用がD53のユビキチン化と分解を引き起こしていると考えられる。イネには3種類のTPL/TPL関連タンパク質（TPR）が存在し、D53はイネTRPと相互作用をすることが確認された。よって、TPRコリプレッサーがストリゴラクトンシグナル伝達の制御因子として機能しているものと思われる。以上の結果から、D53 はSCF^D3ユビキチン化複合体の基質をコードしており、D53はストリゴラクトンシグナル伝達の抑制因子として機能していると考えられる。

イネdwarf53 （d53 ）変異体は、草丈が低く、分けつ数が多く、茎が細く、冠根が短い表現型を示す半優性の変異体である。中国 南京農業大学のWan ら［Nature (2013) 504:406-410.］は、d53 変異体ではストリゴラクトン（SL）生合成経路のカロテノイド裂開ジオキシゲナーゼ8（CCD8）をコードするD10 の発現量が高く、腋芽の成長を阻害するFINE CULM 1 （FC1 ）の発現量が低くなっていることを見出した。このことから、D53 はSLの生合成かシグナル伝達に関与していることが示唆される。d53 変異体は、合成SLであるGR24を添加しても腋芽の成長は阻害されず、内生SL含量が高いことから、SL非感受性の変異体であると考えられる。マップベースクローニングの結果、d53 ではLOC_Os11g01330遺伝子の第3エクソンに1塩基の置換と15塩基の欠損があり、このことによって翻訳産物は1アミノ酸の置換と5アミノ酸の欠損を起こすことがわかった。野生型もしくは変異型のD53 をアクチンプロモーター制御下で発現させた野生型のイネは、どちらのD53 を発現させた場合も分けつ数が増加する表現型を示し、RNAiによってD53 をノックダウンした形質転換イネは分けつ数が減少した。したがって、D53はSLによる分枝阻害経路において抑制因子として作用し、d53 はD53活性が強まった機能獲得変異であると考えられる。D53 は1131アミノ酸からなるタンパク質をコードしており、イネゲノム中にはアミノ酸レベルで96.6％の相同性のあるホモログ（D53-like、LOC_Os12g01360）が存在していた。D53様タンパク質は他の単子葉植物や双子葉植物においても見出されたが、下等植物や動物、微生物には見られなかった。D53タンパク質は、二次構造がクラスI Clp ATPaseファミリーと類似性が見られ、C末端側には、TOPLESSファミリータンパク質と相互作用をして転写抑制に関与するとされているEARモチーフによく似た配列が含まれていた。D53 はイネの様々な組織で発現しており、GR24処理によって発現量が増加した。また、D53タンパク質は主に核に局在していた。イネのSLシグナル伝達においては、F-boxタンパク質のD3とα/βヒドロラーゼのD14が重要な因子であり、D14のシロイヌナズナオーソログのAtD14、ペチュニアオーソログのDAD2は直接SLを受容することが指摘されている。酵母two-hybrid アッセイの結果、D53とd53はGR24存在下でD14と物理的に相互作用をすることが示された。D14とD3もGR24存在下で物理的相互作用をすることから、SLはD14、D3、D53の複合体形成を促進する作用があることが示唆される。野生型植物において、D53タンパク質はGR24処理によって速やかに分解されたが、d3 変異体やd14 変異体では分解は起こらなかった。また、D53タンパク質はプロテアソームによって分解されること、変異型d53タンパク質はD53タンパク質よりもGR24処理に対して安定であることがわかった。よって、SLはプロテアソーム系を介したD14、D3によるD53の分解を引き起こしていると考えられる。d53タンパク質がSLによる分解誘導に対して非感受性であることが、d53 変異体の半優性の表現型をもたらしていると考えられる。d3 d53 二重変異体やd14 d53 二重変異体は、それぞれの単独変異体の表現型と比較して明確な相加効果が見られないことから、D3 、D14 、D53 は同一のシグナル伝達経路において作用していると考えられる。d3 変異体およびd14 変異体においてRNAiによりD53 遺伝子をノックダウンすると、野生型に近い表現型を示すことから、D53 はD3 、D14 の下流に位置しており、D53タンパク質の蓄積がd3 変異体、d14 変異体のSLシグナル伝達の遮断とわい化や分けつ数の増加を引き起こしていると考えられる。以上の結果から、D53はイネのストリゴラクトンシグナル伝達経路において抑制因子として機能し、ストリゴラクトンはD14、D3を介してD53のプロテアソーム系による分解を誘導していると考えられる。