論文）ストリゴラクトンによる根表皮細胞のPIN2タンパク質の局在変化

Strigolactone analog GR24 triggers changes in PIN2 polarity, vesicle trafficking and actin filament architecture
Pandya-Kumar et al.  New Phytologist (2014) 202:1184-1196.
doi: 10.1111/nph.12744

ストリゴラクトン（SL）はシロイヌナズナの根毛伸長を促進することが知られている。根毛伸長の制御にはオーキシン排出キャリアのPIN2が関与していることから、イスラエル 農業研究機関（ARO）ボルカニセンターのKoltai らは、SLとPIN2との関係を調査した。PIN2 プロモーター制御下でPIN2-GFP融合タンパク質を発現するコンストラクトを導入したシロイヌナズナ芽生えを合成SLのGR24で処理すると、一次根伸長領域表皮細胞の細胞膜の上側のPIN2-GFPシグナルが増加し、細胞膜上のPIN2の極性（細胞膜上側と横側との比）も増加した。このような変化は、オーキシン取込キャリアであるAUX1では同様の試験を行なっても見られなかった。よって、SLは根伸長領域の表皮細胞細胞膜上のPIN2タンパク質の極性に影響していると考えられる。SL非感受性変異体max2 の根伸長領域表皮細胞でのPIN2-GFPシグナルの強度と極性は野生型と同等であったが、GR24処理によるPIN2-GFPシグナルの表皮細胞膜上の増加や極性変化は起こらなかった。よって、SLによるPIN2タンパク質の増加や分布の変化はMAX2に依存した作用であることが示唆される。max2 変異体でのPIN2 発現量は野生型よりも僅かに低く、野生型ではGR24処理によってPIN2 発現量が増加したが、max2 変異体ではPIN2 発現量に変化は見られなかった。よって、SLシグナルはMAX2に依存してPIN2 の発現を誘導していることが示唆される。PINタンパク質は細胞膜とエンドソームの間を恒常的に循環しており、この小胞輸送がPINタンパク質の細胞膜上の局在を決定している。小胞輸送の特異的阻害剤であるブレフェルジンA（BFA）処理をすると、野生型ではGR24処理によってPIN2タンパク質を含んだBAFボディが増加したが、max2 変異体ではそのような変化見られなかった。このことから、GR24処理はMAX2に依存してPIN2タンパク質のエンドサイトーシスを誘導していることが示唆される。エンドソームマーカーのARA7とGFPとの融合タンパク質を発現するシロイヌナズナを用いて、一次根伸長領域表皮細胞でのエンドソームの運動速度を見たところ、GR24処理はエンドソームの運動速度を速めることがわかった。max2 変異体のエンドソームの運動速度は野生型と同等であったが、GR24を添加しても運動速度の変化は見られなかった。したがって、GR24はMAX2に依存して一次根伸長領域の表皮細胞でのエンドソームの運動を誘導していることが示唆される。細胞の小胞輸送にはF-アクチンが関与していることから、TALIN-GFPを導入してアクチン繊維を標識し、根端伸長領域表皮細胞のアクチン構造を観察したところ、GR24処理により細い繊維の割合の増加と太い繊維の減少、繊維の偏在性の低下が見られた。しかしながら、max2 変異体ではそのような変化は見られなかった。よって、GR24はMAX2に依存してアクチン繊維の束化を低下させていることが示唆される。アクチン重合阻害剤LatBによるアクチン繊維の脱重合はGR24処理によって促進されることから、GR24はF-アクチンの束化を低下させることで、アクチンを不安定化し、LatBによるアクチン脱重合を促進していると考えられる。アクチン繊維の束化の低下はアクチン繊維の動態を増加させることが知られている。GR24処理は一次根伸長領域表皮細胞のアクチン繊維の動態を増加させ、この増加はMAX2に依存していることがわかった。GR24処理によるアクチン構造や動態の変化は、オーキシン処理によっても引き起こされた。SLのPIN2、小胞輸送、アクチンの動態に対する効果が根毛伸長促進と関連しているかを見るために、ACTIN2 （ACT2 ）の変異体der1 、PIN2 の変異体eir1 、PIN輸送関連タンパク質TRANSPORT INHIBITOR RESISTANT3の変異体tir3 およびmax2 変異体にGR24処理をして根毛の伸長を見た。その結果、eir1 変異体はGR24に対する感受性が野生型よりも高くなっていたが、tir3 変異体、der1 変異体、max2 変異体は野生型よりもGR24に対する感受性が低下していた。一方、これらの変異体の根毛伸長はオーキシン処理によって根毛伸長が促進された。以上の結果から、GR24による根毛伸長促進はアクチン繊維の束化の低下による小胞輸送の制御が関連しているが、単純にPIN2に依存したものではないと思われる。

論文）グルコースによる根の伸長阻害機構

Glucose inhibits root meristem growth via ABA INSENSITIVE 5, which represses PIN1 accumulation and auxin activity in Arabidopsis
Yuan et al.  Plant, Cell & Environment (2014) 37:1338-1350.
DOI: 10.1111/pce.12233

グルコースは植物の成長において炭素源としてだけでなく、ホルモン様のシグナル物質としても機能しており、3-5％の高濃度グルコースはシロイヌナズナ芽生えの一次根の伸長を阻害する。中国 武漢大学のLu らは、グルコースによる根の伸長阻害機構を解析した。シロイヌナズナ芽生えの一次根はグルコース添加により分裂領域の長さが短くなり、これは細胞数の減少によるものであることがわかった。また、高濃度グルコースは根の伸長領域と分裂領域の大きさと細胞長を減少させた。しかし、芽生えにショ糖を添加した際には、根の長さ、分裂領域の長さや細胞数に変化は見られなかった。また、代謝されない3-オルソ-メチル-グルコース（3-OMG）を添加すると、根の長さが短くなり、分裂領域の長さと細胞数の減少が起こった。これらの結果から、グルコースは根の分裂組織の成長を阻害するシグナル分子として作用していると考えられる。根の分裂領域が短くなる原因としては、分裂組織細胞の分裂能の低下か分裂組織細胞の伸長・分化過程への早期移行が考えられる。そこで、マーカーとしてCYCB1;1::GUS コンストラクトを導入した形質転換体で根分裂組織の分裂活性を見たが、グルコース添加による変化は見られなかった。また、QC25::GUS もしくはQC46::GUS を導入した形質転換体で分裂組織の幹細胞の活性を見たが、こちらもグルコース添加による変化は見られなかった。したがって、根の分裂領域の伸長・分化への移行がグルコース添加によって早まったことで分裂領域が短くなったと考えられる。植物の成長を調節しているオーキシンの分布について、オーキシンセンサーであるDII-VENUSを用いて調査したところ、グルコース処理は根のオーキシン活性を低下させることがわかった。また、グルコース処理は根端部のオーキシン量を低下させていた。オーキシンの分布は極性輸送よって調節されている。芽生えをオーキシン輸送阻害剤ナフチルフタラミン酸（NPA）で処理すると、グルコース処理をした場合と同様に根分裂組織の細胞数や長さの減少が起こるが、NPAとグルコースを同時に処理しても根分裂組織の異常が相加的に悪化することはなかった。よって、グルコースはオーキシン極性輸送に影響を及ぼすことで根分裂組織の細胞数や長さの制御に関与していると思われる。シュートから根へのオーキシン極性輸送に関与しているオーキシン排出キャリアの変異体pin1 の根は、グルコース処理に対する感受性が低下していた。野生型植物の根のPIN1 発現量はグルコース処理による変化は見られなかったが、PIN1タンパク質量は減少することがわかった。よって、グルコースはPIN1タンパク質の蓄積を制御していると思われる。グルコースによる成長制御はアブシジン酸（ABA）シグナルが関与していることが報告されており、ABA非感受性abi5 変異体はグルコース処理に対して非感受性、ABI5 過剰発現個体は高感受性となった。また、グルコース処理をした芽生えの根ではABI5 の発現が増加していた。以上の結果から、グルコースはABI5 の発現を誘導することでPIN1タンパク質の蓄積を低下させ、このことによって根のオーキシン活性が低下して根分裂組織領域が短くなると考えられる。

論文）根からシュートへのサイトカイニン輸送に関与するABCトランスポーター

Arabidopsis ABCG14 is essential for the root-to-shoot translocation of cytokinin
Ko et al.  PNAS 2014 111 (19) 7150-7155.
doi: 10.1073/pnas.1321519111

トランス-ゼアチン（tZ）型サイトカイニンは根の維管束で合成され、木部から地上部へと輸送されてシュートの発達を調節している。一方、イソペンテニルアデニン（iP）型サイトカイニンはシュートから根へと輸送され、根分裂組織の維管束パターン形成に関与している。しかしながら、サイトカイニンの輸送機構については明らかとなっていない。韓国 浦項工科大学校（POSTECH）のLee らは、サイトカイニンの輸送を担うトランスポーターの探索を目的に、その候補として、１）サイトカイニン生合成酵素をコードするISOPENTENYLTRANSFERASE （IPT ）の発現している根師部コンパニオン細胞で発現している、２）サイトカイニン生合成遺伝子として重要なIPT3 と発現の挙動が一致している、３）サイトカイニン処理によって発現が誘導される、の3条件に一致する遺伝子のATP-結合カセット（ABC）トランスポーターサブファミリーG14（AtABCG14 ）に着目して解析を行なった。シロイヌナズナatabcg14 変異体の芽生えは、葉が野生型よりも小さいが、根は野生型よりも長い。成熟個体は、ロゼット葉が小さく、茎が短く細い。花序茎の木部および師部の細胞数が少なく、細胞の大きさも小さい。植物体あたりの長角果数および種子数が少ないが、種子のは野生型よりも大きかった。このようなatabcg14 変異体のわい化した表現型は、サイトカイニン生合成の変異体やサイトカイニン受容体の変異体において見られる表現型と類似している。そこで、atabcg14 変異体に毎日tZを噴霧したところ、小さい葉と短い茎の表現型が回復した。しかしながら、iPの噴霧ではわい化した表現型は回復しなかった。AtABC14G は根とシュートの両方で発現しているが、根の発現量が高く、根では根端以外の中心柱全域で発現していた。そしてこの発現部位はサイトカイニン合成遺伝子のIPT3 やCYP735A2 の発現部位と重複していた。また、AtABCG14タンパク質は細胞膜に局在していた。atabcg14 変異体のtZ型サイトカイニン量はシュートでは野生型よりも低く、根では高くなっていた。一方、atabcg14 変異体のiP型サイトカイニン量は根もシュートも野生型よりも高くなっていた。サイトカイニン応答のマーカー遺伝子であるタイプA シロイヌナズナレスポンスレギュレーター（ARR）遺伝子のARR7 、ARR15 の発現量は、atabcg14 変異体のシュートでは野生型よりも低く、根では高くなっていた。放射性同位元素で標識したtZを芽生えの根に与えてシュートの放射活性を見たところ、atabcg14 変異体は野生型よりも低かった。atabcg14 変異体のシュートのARR5 の発現量は野生型よりも低いが、芽生え全体をサイトカイニンを含む培地に浸漬するとARR5 の発現量は野生型と同等になった。atabcg14 変異体の木部浸出液に含まれるtZ型サイトカイニン量は野生型よりも90％以上少ないが、iP型サイトカイニン量は差が見られなかった。よって、AtABCG14はtZ型サイトカイニンの根からシュートへの木部を介した輸送に必要であることが示唆される。atabcg14 変異体のシュートの表現型がサイトカイニン輸送の低下によるものであることを確認するために、野生型の根にatabcg14 変異体のシュートを接いだところ、シュートの成長が野生型と同等にまで回復した。よって、野生型の根はatabcg14 変異体のシュートを正常に成長させるのに十分な量のサイトカイニンを供給していることが示唆される。一方、atabcg14 変異体の根に接いだ野生型のシュートは、atabcg14 変異体のシュートと同様にわい化した。したがって、atabcg14 変異体の根はシュートの正常な成長に必要な量のサイトカイニンを輸送できていないことが示唆される。以上の結果から、AtABCG14はサイトカイニンをアポプラストに輸送するトランスポーターとして機能しており、AtABCG14を介した根からシュートへのサイトカイニン輸送は、シュートの成長に必要であると考えられる。

共同研究を行なった理化学研究所のプレスリリース

論文）APETALA1によるサイトカイニン量の制御と花器官形成

Cytokinin pathway mediates APETALA1 function in the establishment of determinate floral meristems in Arabidopsis
Han et al.  PNAS 2014 111 (18) 6840-6845.
doi: 10.1073/pnas.1318532111

MADS-ドメイン転写因子をコードするAPETALA1 （AP1 ）は花分裂組織の外側のwhorl の器官（がく片と花弁）の形成に関与しており、がく片の腋からの二次花形成の抑制にも関与している。しかしながら、AP1による幹細胞の分裂制御機構に関しては明らかとなっていない。中国科学院 遺伝学発生生物学研究所のJiao らは、AP1による分裂組織活性の制御はサイトカイニンシグナルが関与しているのではないかと考え、解析を行なった。シロイヌナズナap1-1 変異体の花ではサイトカイニンによって発現が誘導されるARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR 5 （ARR5 ）の転写産物量が野生型よりも多くなっていた。また、サイトカイニンシグナルによって活性化される合成レポーターpTCS::GFP -ER の発現量やGFP蛍光強度も増加していた。ap1-1 変異体の花序の内生サイトカイニン含量は野生型よりも高く、特に、ゼアチンリボシドとイソペンテニルアデニンが増加していた。よって、AP1はサイトカイニン量とサイトカイニン応答を抑制していることが示唆される。花序をサイトカイニンアナログのベンジルアミノプリンで処理したところ、がく片の腋から二次花が形成されるap1 変異体の表現型と類似した形態変化を示し、花分裂組織が大型化した。サイトカイニン生合成を律速している酵素をコードするISOPENTENYLTRANSFERASE 8 （IPT8 ）をAP1 プロモーター制御下で発現させた形質転換シロイヌナズナも、ap1 変異体と類似した花の形態異常を示した。ap1 変異体にサイトカイニン受容体ARABIDOPSIS HISTIDINE KINASE （AHK ）の変異を導入したところ、二次花を形成する表現型が緩和された。ap1-1 変異体の花ではサイトカイニン生合成酵素遺伝子のLONELY GUY1 （LOG1 ）の発現量が野生型よりも高く、サイトカイニン分解酵素遺伝子CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE3 （CKX3 ）の発現量が低くなっていた。AP1にグルココルチコイド受容体（GR）を付加した融合タンパク質を発現するコンストラクトを導入したap1-1 cal1-1 二重変異体をデキサメタゾン（Dex）処理してAP1を活性化すると、2時間以内にLOG1 mRNAの減少とCKX3 mRNAの増加が起こり、この転写産物量変化はタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（CHX）存在下でも起こった。よって、LOG1 とCKX3 はAP1の直接のターゲットであると思われる。LOG1 遺伝子およびCKX3 遺伝子のプロモーター領域にはMADS-ドメインタンパク質が結合するとされるCArGモチーフが含まれており、クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイから、AP1はこのモチーフを含む断片と相互作用をすることがわかった。また、LOG1 プロモーターまたはCKX3 プロモーターの制御下でルシフェラーゼ（LUC ）を発現するコンストラクトを用いたプロトプラスト一過的形質移入アッセイから、AP1はLOG1 プロモーター制御下のLUC 発現を抑制し、CKX3 プロモーター制御下のLUC 発現を活性化することがわかった。したがって、AP1はLOG1 およびCKX3 の発現をCArGモチーフに結合することで制御していると考えられる。LOG1 プロモーター制御下でGUS を発現するコンストラクトを導入したap1-1 変異体では、野生型では発現の見られないようなステージにおいて強いGUS活性が見られた。また、CKX3 は花器官の発達初期に発現が見られるが、ap1-1 変異体発現量が低下し、特に二次花が形成させるがく片の腋での発現が低下していた。AP1 プロモーター制御下でLOG1 mRNAをターゲットとする人工マイクロRNAを発現させるコンストラクト（pAP1::amiR-LOG1 ）やCKX3 を発現させるコンストラクト（pAP1::CKX3 ）を導入したap1-4 変異体は、二次花形成をする表現型が抑制された。また、LOG1 の残存発現量と二次花形成の頻度との間に相関が見られた。AP1は花成時期を制御しているMADS-ドメイン遺伝子のSHORT VEGETATIVE PHASE （SVP ）、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1 （SOC1 ）、AGAMOUS-LIKE 24 （AGL24 ）の発現を抑制しており、これらの遺伝子を過剰発現させると二次花が形成される。AGL24 を過剰発現させた形質転換体の花序ではARR5 の転写産物量が増加しており、AP1 プロモーター制御下でIPT8 を発現させた形質転換体の花序ではSVP 、SOC1 、AGL24 の発現量が増加していた。したがって、サイトカイニンシグナルとこれらの花成時期制御遺伝子はお互いを相互に活性化していると考えられる。以上の結果から、AP1はサイトカイニン生合成の抑制とサイトカイニン分解の活性化を介して花分裂組織での正常な器官形成に貢献していると考えられる。

植物観察）北海道バイケイソウ観察 野幌

今日は野幌森林公園へバイケイソウの観察に行きました。こちらで調査しているエリアでは昨年400個体強の花成個体が見られましたが、今年は花成個体を2個体しか見つけられませんでした。調査エリアには600個体以上のバイケイソウが生えており、その中で2個体ですから、ほぼ誤差のような、昨年花成し忘れた個体が間違って花成したというような程度のもかと思います。公園内の幾つかの支線を歩いてみましたが花成個体は上記に加えて5個体見つけられただけでした。よって、公園全体でも花成個体数は数十個体しかないのではないかと思います。

 

野幌でもバイケイソウ花成個体は非常に少ない

 

僅かに見られた花成個体

植物観察）北海道バイケイソウ観察 旭川

今日は旭川のバイケイソウ群生地に行きました。昨年250個体程度の花性個体が見られた20m×30m程のエリアで今年は花性個体がまったく見られず、同一林内の調査エリア以外のところでも花性個体は確認できませんでした。よって、この地域の林床性のバイケイソウでは一斉開花の翌年は花成個体がない、花成する潜在能力のある個体は昨年すべて花成したということになると思われます。

 

旭川の調査地ではバイケイソウ花成個体が全く見られませんでした