冬の西表島へ行ってきました。お目当ては、昨年同様、イリオモテソウです。昨年（2013年12月7日）は見つけた群生が殆ど蕾の状態でちょっと残念な結果でしたので、今回は時期を遅らせて観察に行ってきました。しかし残念なことに、今年はその群生の個体数が激減しており、「一面のイリオモテソウ」といった景色は見ることができませんでした。しかも花期も少し過ぎてしまっていました。まあ、野生の植物のことですし、八重山の緩慢な季節変動を考えると「一面のイリオモテソウ」状態というのはなかなかお目にかかれないのだろうと思います。他の花としては、サツマイナモリ、ツワブキ、オキナワテイショウソウ、セイタカスズムシソウを見ることができました。
イリオモテソウ 期待していた「一面のイリオモテソウ」は見ることができなかった
ツワブキ
セイタカスズムシソウ
オキナワテイショウソウ 西表島のものは花序が大きく葉の鋸歯がない
Genome-Wide Study of KNOX Regulatory Network Reveals Brassinosteroid Catabolic Genes Important for Shoot Meristem Function in Rice
Tsuda et al. The Plant (2014) 26:3488-3500.
doi:10.1105/tpc.114.129122
knotted1-like homeobox（KNOX）転写因子は植物の茎頂分裂組織（SAM）の属性維持を担っており、複数の遺伝子をターゲットとしていることが知られている。米国 カリフォルニア大学バークレー校 植物遺伝子発現センターのHake らは、イネNKOXタンパク質のOryza sativa homeobox1（OSH1）の制御ネットワークの解析を行った。OSH1にグルココルチコイド受容体（GR）ドメインを付加した融合タンパク質（OSH1-GR）を過剰発現させたイネをデキサメタゾン（DEX）処理したところ、高濃度のDEX処理をしたイネでは複数のシュートが形成され、KNOX 過剰発現系統と類似した表現型を示した。中、低濃度のDEX処理をしたイネは、葉身のねじれ、短い葉鞘、葉身の直立といったブラシノステロイド（BR）の欠損もしくは非感受性の変異体と類似した表現型を示した。そこで、低濃度DEX処理をしたイネにブラシノライド（BL）を与えたところ、葉鞘が短くなる表現型が改善された。このことから、OSH1 の過剰発現による表現型変化の一部はBR経路が抑制されたために引き起こされていることが考えられる。また、ラミナジョイント試験において、DEX処理したOHS1 過剰発現系統は、BR応答性が低下しており、OSH1 はBRシグナル伝達を阻害するかBRの不活化を促進することによってBR経路を抑制していると考えられる。osh1 機能喪失変異体は、第二葉のラミナジョイントの角度が野生型よりも大きく、葉耳が外側に突出し、浸漬発芽した芽生えの鞘葉は野生型よりも長くなっており、このような表現型は野生型をBR処理した際に観察される表現型と類似していた。これらの結果から、OSH1 はBR経路を負に制御していることが考えられる。osh1 変異体は、低頻度（～2％）で葉身と葉鞘との境界領域や生長点と葉原基の境界が不明瞭となる形態異常を示した。ChIP-seqの結果、4662遺伝子がOSH1の直接のターゲット候補として見出され、OSH1は遺伝子の5'上流領域に優先的に結合していた。OSH1-GR を過剰発現させた植物体の若い葉をDEX処理すると1241遺伝子の発現に変化が見られ、このうち391遺伝子（31.5％）にOSH1が結合し、そのうち380遺伝子は発現量が増加、11遺伝子は発現量が減少した。よって、OSH1は転写活性化因子として機能していることが示唆される。ChIP-seqの結果を見ると、BRをC26ヒドロキシル化して不活性化するP450をコードするシロイヌナズナBAS1 のホモログが含まれていた。イネにはBAS1 ホモログがCYP734A2 、CYP734A4 、CYP734A5 、CYP734A6 の4つがあり、いずれの遺伝子もOSH1の直接のターゲットとなっていた。これらの遺伝子はOSH1-GR 発現個体をDEX処理すると発現量が増加し、osh1 変異体では野生型よりも発現量が減少していた。また、CYP734A を過剰発現させた個体は、葉身のねじれや短い葉鞘といったBR欠損の表現型を示し、OSH1 過剰発現個体と類似した形態を示した。CYP734A6 プロモーター制御下でGFPを発現させたところ、茎頂分裂組織、茎、若い葉原基が強い蛍光を示し、腋芽の分裂組織や若い葉でも蛍光が見られた。これらのCYP734A6 の発現部位はOSH1 の発現部位と大部分が重なっていた。したがって、OSH1は茎頂分裂組織においてBR不活性化酵素の発現を直接活性化していると考えられる。RNAiでCYP734A をノックダウンした個体はosh1 変異体と表現型が類似していた。イネCYP734A6 遺伝子のトウモロコシのオーソログと考えられるGRMZM2G138750 は、トウモロコシKNOTTED1 （KN1 ）遺伝子の機能獲得変異体Kn1-N の葉において発現量が増加していた。よって、KNOX転写因子によるBR不活性化酵素遺伝子の制御は単子葉植物において保存された制御機構であると考えられる。以上の結果から、KNOX転写因子によるブラシノステロイド量の局所的な制御は、茎頂分裂組織の属性維持において重要であると考えられる。
Arabidopsis RAV1 transcription factor, phosphorylated by SnRK2 kinases, regulates the expression of ABI3, ABI4, and ABI5 during seed germination and early seedling development
Feng et al. The Plant Journal (2014) 80:654-668.
DOI: 10.1111/tpj.12670
シロイヌナズナRAV1転写因子は、APETALA2/Ethylene Responsive Factor（AP2/ERF）ファミリーの中のRAV（Related to ABI3/VP1）サブファミリーに属しており、AP2-likeドメインとB3-likeドメインの2つのDNA結合ドメインを有している。また、RAV1は抑制ドメインとして知られているRLFGVモチーフを含んでいる。浸漬した種子のRAV1 転写産物量は非常に少ないが、MS培地に移して発芽が始まると劇的に増加する。中国農業大学のChen らは、RAV1 プロモーター制御下でGUS を発現するコンストラクト（ProRAV1:GUS ）を導入したシロイヌナズナを用いてRAV1 の発現パターンを解析した。この形質転換体種子は、浸漬しただけではGUS染色は殆ど見られないが、発芽後に染色が強まり、特に子葉が強く染まった。また、RAV1 の転写はアブシジン酸（ABA）の添加によって抑制された。これらの結果から、RAV1は種子発芽と芽生えの初期成長に関与していると考えられる。RAV1 の発現を抑制した系統は、野生型よりもABA添加培地での発芽率や子葉の緑化の程度が低くなっていた。RAV1 を過剰発現させた系統は、通常の培地での発芽は野生型と同等であったが、ABA添加培地では野生型よりも発芽や芽生えの成長の抑制程度が低く、ABA非感受性の表現型を示した。よって、RAV1転写因子は種子発芽と芽生えの初期成長の際のABAシグナル伝達において重要な役割を演じていると考えられる。RAV1 発現抑制系統や過剰発現系統でのABA応答遺伝子の転写産物量を比較したところ、ABA INSENSITIVE 3 （ABI3 ）、ABI4 、ABI5 、Em1 、Em6 の転写産物量が発現抑制系統で高く、過剰発現系統で低くなっていた。RAV1はCAACAとCACCTGの2種類のDNAモチーフに結合することが知られている。ABI3 、ABI4 、ABI5 遺伝子のプロモーター領域には複数のCAACAモチーフが含まれており、RAV1はこれらの遺伝子のプロモーターに結合することが確認された。よって、RAV1はABI3 、ABI4 、ABI5 遺伝子の発現を直接制御していると考えられる。RAV1 発現抑制系統にabi5 変異を導入した系統は、種子発芽や子葉緑化においてabi5 変異体と同様にABA非感受性となった。したがって、ABI5 はRAV1 よりも上位に位置していると考えられる。SNF1関連タンパク質キナーゼ2（SnRK2）のSnKR2.2、SnRK2.3、SnRK2.6はABAシグナル伝達の正の制御因子として機能しており、核に局在する。BiFCアッセイや共免疫沈降（Co-IP）アッセイから、RAV1はこられのSnRK2と相互作用をし、これらのタンパク質キナーゼによってリン酸化されることがわかった。また、SnRK2によるRAV1のリン酸化はABAの添加によって促進された。ベンサミアナタバコを用いた一過的発現解析から、RAV1はABI5 の転写を抑制すること、SnKR2.2、SnRK2.3、SnRK2.6はRAV1によるABI5 転写の抑制を低下させることがわかった。RAV1 とSnRK2.3 を過剰発現させた系統は、RAV1 過剰発現系統よりもABA非感受性が弱くなっており、ABI5 転写産物量が増加していた。したがって、SnKR2.2、SnRK2.3、SnRK2.6はRAV1の活性を抑制していると考えられる。以上の結果から、RAV1は種子発芽および芽生えの初期成長においてABAシグナル伝達の負の制御因子として機能していると考えられる。
AUXIN RESPONSE FACTOR 3 integrates the functions of AGAMOUS and APETALA2 in floral meristem determinacy
Liu et al. The Plant Journal (2014) 80:629-641.
DOI: 10.1111/tpj.12658
MADS-ドメイン転写因子のAGAMOUS（AG）は、雄ずいと心皮の形成に関与しており、分裂組織の維持に関与しているWUSCHEL （WUS ）の発現を抑制している。そのため、ag-1 機能喪失変異体は、WUS の発現時期が延長し、花の中に花ができる表現型を示す。弱いag アレルのag-10 変異体は、長角果の内部で組織形成が起こることで膨らんだ形態を示すものが生じる場合があり、これは花分裂組織の幹細胞活性が維持されて花器官の属性異常が起こることによって引き起こされていると考えられる。米国 カリフォルニア大学リバーサイド校のChen らは、ag-10 変異体をEMS処理して得られた集団から、すべての長角果が膨らんだ形態を示し、ag-1 変異体ほど極端な表現型とならない変異体を単離した。このag-10 変異が強調された変異体は、がく片、花弁、雄ずいの形態は正常だが、内部に器官が形成されることで膨らんで癒合しない心皮を生じた。マップベースクローニングの結果、この変異はAUXIN RESPONSE FACTOR 3 （ARF3 ）遺伝子の第8エクソンと第8イントロンの接合部がGからAに置換してmRNAの正常なスプライシングを妨げていることがわかった。arf3-29 と命名したこの変異の効果を検証するために、arf3/ett アレルの機能喪失変異ett-3 をag-10 変異体に導入して表現型を観察したところ、ag-10 arf3-29 変異体と同様の形態異常を示した。また、ARF3 を自身のプロモーター制御下で発現させたag-10 arf3-29 変異体は表現型が回復した。したがって、arf3-29 変異はag-10 arf3-29 変異体の花分裂組織異常の強調に関与していることが示唆される。arf3-29 単独変異体は、雄ずい群の発達異常などのett-3 変異体と類似した表現型を示した。ag-10 arf3-29 変異体の花分裂組織の属性異常を分子レベルで解析するために、in situ ハイブリダイゼーションでWUS の発現パターンを見たところ、花序でのWUS の発現部位に関してはag-10 arf3-29 変異体とag-10 変異体の間で違いは見られなかったが、ag-10 arf3-29 変異体ではWUS の発現がag-10 変異体よりも長く続いていることがわかった。よって、ARF3 はWUS の発現抑制に関与していることが示唆される。ARF3 とWUS の遺伝的な関係を見るために、ag-10 arf3-29 wus-1 三重変異体を作成して形態を観察したところ、この変異体はwus-1 単独変異体と同様に花器官の発達が未成熟な段階で止まることがわかった。よって、wus-1 変異はag-10 arf3-29 変異よりも上位にあると考えられる。arf3-29 変異体でのAG 遺伝子の転写産物量は野生型と同等であり、ARF3タンパク質はAG 遺伝子に結合しないことから、ARF3 はAG の発現を制御していないと考えられる。ag-10 変異体ではARF3 の転写産物量が減少しており、グルココルチコイド受容体を付加したAGを発現させたag-1 変異体をDEX処理するとARF3 転写産物量が増加した。しかしながら、AGタンパク質はARF3 遺伝子に結合しなかった。よって、AGは間接的にARF3 の発現を制御していると考えられる。ag-1 arf3-29 二重変異体はag-1 単独変異体よりも花の形態異常が強まること、ag-10 arf3-29 二重変異体にAGのターゲット遺伝子で花分裂組織の属性に部分的に関与しているKNUCKLES （KNU ）の機能喪失変異knu-1 を導入すると花の形態異常がより強くなることから、ARF3 は花器官の属性決定においてAG経路とは一部独立して機能していると考えられる。AGとは独立して花分裂組織の属性を制御しているAPETALA2（AP2）は、直接ARF3 の発現を抑制していることがわかった。花器官の発達過程におけるARF3 の発現パターンをin situ ハイブリダイゼーションで観察したところ、花序分裂組織では花分裂組織が形成される末端部で発現しており、その後分裂組織の葉脈部で発現が強まり、雄ずいと心皮の原基に発現が集中した後、発達後期には花弁、雄ずい、雌ずいの背軸側で発現が見られた。GFPを付加したARF3をARF3 プロモーター制御下で発現させてARF3-GFPタンパク質の分布を見たところ、GFP蛍光はARF3 mRNAの分布していない部位においても見られた。花器官の発達過程においてARF3-GFPが検出される部位とWUS が発現している部位は重複が見られた。そこで、tasiR-ARFsによる制御受けないARF3mとGFPの融合タンパク質をWUS プロモーターおよびターミネーター制御下でag-10 arf3-29 変異体で発現させたが、花分裂組織の属性の回復は起こらなかった。よって、ARF3 が適切な部位で発現することが花分裂組織の属性決定において重要であると考えられる。WUS 遺伝子にはプロモーター領域と第１イントロンにARFファミリーが結合するAuxRE（TGTCTC）に類似した配列が含まれており、ARF3はWUS プロモーター領域の配列に結合することがわかった。AGもWUS 遺伝子プロモーターに結合することが知られており、AGはARF3のWUS 遺伝子プロモーター領域への結合を促進することがわかった。以上の結果から、花器官原基におけるARF3 遺伝子発現およびARF3タンパク質の分布は、AGとは独立して花分裂組織の属性決定に関与していることが示唆される。
UBC13, an E2 enzyme for Lys63-linked ubiquitination, functions in root development by affecting auxin signaling and Aux/IAA protein stability
Wen et al. The Plant Journal (2014) 80:424-436.
DOI: 10.1111/tpj.12644
タンパク質のポリユビキチン化による修飾は、ユビキチンの結合の仕方によって機能が異なる。ユビキチンC末端のGly残基とユビキチン内のLys残基が結合することでポリユビキチン化が起こり、48番目のLys残基（K48）を介したポリユビキチン化はタンパク質のプロテアソーム系による分解のシグナルとなる。63番目のLys残基（K63）を介したポリユビキチン化は、ターゲットタンパク質の活性を修飾することでシグナル伝達に関与することが酵母や動物での研究で明らかとなっている。K63ポリユビキチン化は、E2ユビキチン結合酵素のUBC13とそのパートナーであるUEV1によって形成されるヘテロ二量体が触媒しており、両者のホモログはシロイヌナズナにも見られる。カナダ サスカチュワン大学のWang らは、植物におけるUBC13を介したポリユビキチン化の役割を解析した。シロイヌナズナには2つのUBC13遺伝子UBC13A とUBC13B があり、それぞれのT-DNA挿入機能喪失変異体は成長や形態に変化は見られないが、ubc13 二重変異体は野生型よりも成長が遅延した。特に芽生えの根の成長が遅く、主根はジグザグに成長し、主根長と側根数が1/3に減少した。これらの結果から、UBC13A とUBC13B は冗長的に作用し、UBC13活性の欠損は主根の成長と側根の発達を大きく低下させることが示唆される。野生型と比較して、ubc13 二重変異体の根は根毛が殆どない。しかし、まばらに非常に短い突起物が見られることから、根毛形成誘導は起こっていると考えられる。また、ubc13 二重変異体は根端の構造に異常が見られ、根端分裂組織が小さく、根冠が形成されなかったり根端から剥がれたりしていた。ubc13 二重変異体は内生オーキシン量が野生型の半分程度であった。しかし、ubc13 二重変異体芽生えをオーキシン（NAA）処理しても側根や根毛の発達や主根の成長に変化は見られず、オーキシン応答性が低下していた。したがって、ubc13 二重変異体の根の成長低下は単純に内生オーキシン量が低下していることによって引き起こされているのではないと考えられる。オーキシン応答DR5プロモーター制御下でGFPを発現するコンストラクトを導入したubc13 二重変異体の根端部は、GFP発現量が野生型よりも低く、コルメラ細胞でのGFP蛍光が見られなくなっていた。芽生えをNAA処理すると、野生型では根端部のGFP蛍光が強まるが、ubc13 二重変異体ではGFP蛍光の増加はあまり見られなかった。オーキシンシグナル伝達の阻害因子として機能するAux/IAAタンパク質のAXR3/IAA17のドメインⅠ、ⅡにGUSを付加した融合タンパク質（AXR3NT-GUS）をダイズ熱ショックプロモーター制御下で発現するコンストラクトを導入したubc13 二重変異体芽生えの主根は熱ショックを与える前から高いGUS活性を示し、一過的に熱ショックを与えてGUS活性を上昇させた後の活性低下が野生型よりも遅くなっていた。よって、UBC13活性の欠損はAXR3NT-GUSタンパク質を増加させていると考えられる。ubc13 二重変異体では、Aux/IAA とSAUR に属するオーキシン応答遺伝子の一部が、NAA処理をしても発現誘導が起こらなかった。以上の結果から、UBC13は根の発達に対して機能しており、それはオーキシンシグナル伝達を抑制するAux/IAAタンパク質の安定化が関与していると思われる。
