光合成の仕組みーPSIIで起こる水の分解

"Mechanism of Tyrosine D Oxidation in Photosystem II"
Keisuke Saito, A. William Rutherford, and Hiroshi Ishikita,

PNAS, vol. 110, No. 19, 7690?7695 (2013).

高等植物や藻類は葉緑体にある膜タンパク質PSIIの内部において、太陽光を利用して水を酸素と水素イオンに分解している。その分子機構が未だに不明である。これをとく鍵はPSIIの中にあって光合成を助ける触媒として働く「Mnクラスター」だと考えられてきた。Mnクラスターの分子構造は長年世界中で研究されてきたが、2011年に岡山大学と大阪市立大学の研究グループが解明。これにより、光合成の水分解反応を分子構造に基づいて研究することがようやくできるようになった（Myブログ　06・18・2013　”いま、Mnクラスターが熱い！”参照）。解明されたMnクラスター周辺の分子構造を見ると、水分子が多数存在していることがわかる。これらの水分子の内、水分解反応に使われる水分子(基質)がどれかを知ることこそが、反応機構を分子レベルで理解するための第1歩である。基質水分子を特定できれば、複数の原子からなるMnクラスターのどの部位で触媒反応が起こるのかがわかり、ひいては反応機構の特定につながる。しかし、分子構造を見ただけでは、どれが基質水分子かはわからないことが問題なのである。

水の分解は

2H₂O(水分子×2)→O₂(酸素分子)+4H⁺(プロトン×4)+4e^-(電子×4)

式で表され、反応に伴って酸素と共にプロトンが生成される。このプロトンはタンパク質内部のMnクラスター付近で生成された後、タンパク質外部へ移動して排出されるという流れである。もしプロトンの移動経路を特定することができれば、その道筋を逆にたどることで、必ず基質水分子に行き着くことができるのである。よって、水分解機構を明らかにするために達成すべき目標は、プロトンがタンパク質内のどの部位を通って排出されるのか、その経路を特定することである。

図1　PSIIの中心部の模式図とその分子進化。青矢印：プロトンの移動、赤矢印：電子の移動、TyrD:アミノ酸残基TyrD.

PSIIの中心部はD1・D2サブユニットという2つの部品からなる(図1)。D1とD2はどちらもよく似た形をしているが、そっくり同じというわけではない。D1はMnクラスターを持つが、D2は持たないという違いがある。これは、タンパク質の分子進化の過程において、D2も本来はMnクラスターを持っていたと思われ、現在はそれが消失してしまったのだと予想される(図1)。水分解後のプロトン排出はD1におけるMnクラスターの近傍で起こる。しかし、D1のこの領域にはプロトン移動経路の候補となる水分子が多く存在するため、一見しただけでは経路を特定することが不可能である。しかし、D2における対応する領域では水分子が少ないため、プロトン移動経路の解析を行うことが容易であるため、研究グループはD2のこの領域に着目し、プロトン移動のエネルギーを量子化学計算によって解析された。

図2　PSIIの中心部の模式図とその分子進化。青矢印：プロトンの移動、赤矢印：電子の移動、TyrD:アミノ酸残基TyrD。

その結果、図2bの通り、唯一のプロトン移動経路が存在することが見出された。この経路は、D2に存在する、アミノ酸残基からプロトンが放出される時に使用されるもので、複数の水分子とアミノ酸残基が水素結合で強固に結ばれて作られていることも判明した。そして、これらの水分子とアミノ酸残基の上を、プロトンはまるでドミノ倒しのように次々に移動していくこともわかった(図2c)。今回の発見は、D2がかつてD1と同じように行っていた水分解反応の痕跡の可能性がある。重要な要素は進化の過程を経ても失われずに残ることが多いことから、もしそうならば、これと同様なプロトン移動経路がD1にも存在しているはずと推測し、D1において対応する場所を調べたところ、水分子とアミノ酸残基からなる経路の発見に至った(図2a)。D1におけるこの経路が、実際に水分解反応で使われているプロトン移動経路であると考えられる。水分解に伴って排出されるプロトンの移動経路が明らかになったことから、水分解反応がMnクラスターのどこで起こっているのかを特定し易くなったという。これにより今後、水分子の化学結合が開裂する仕組みの解明など、より踏み込んだ反応機構の解明に向けた研究が加速することが考えられる。

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ちょっといっぷく47 再びイクオリンの登場と新しい発光蛋白

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 図1　イクオリンはアポイクオリン（白+黄色）、セレンテラジン（Space  filling）、および酸素（パーオキシド）からなる複合体である。パーオキシド生成が見えるがCaイオンはEFハンドに配位していない。EFハンドにCaイオンが配位すると炭酸ガスが外れて光る。最近になって、ようやくそのメカニズムの詳細が判ってきた。 

イクオリンが発見されてから50年が経つ。今でも営々として研究が続けられている。イクオリンがCa2+と特異的に結合すると青色 (λmax=465nm)の瞬間発光を示し、セレンテラミドと二酸化炭素を生成する。そのさいにGFPが傍にあると緑色に輝く。おわんくらげの発光機構はこれに相当する。イクオリンは微量Ca2+の検出や細胞内カルシウムのイメージングに用いられる。

最近、コントロールが容易な色素としてオベリン（図2）が脚光を浴びている。蛋白の形状はイクオリンと変わらないが、発光特性が異なる.

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図2　オベリン（Obelin ）の結晶構造図（PDBID:1QV1、解像度：1.1A）。2個のCa2+イオン（黒色）がEFハンドに配位している。炭酸ガスも酸素原子2個はまだ基質にある。従って、まだ、この段階ではまだ光らない。3個配位してやっと光る（基質上部にあるグリセロールおよび藍色球形のKイオンはここの議論と関係なし）。

「文献」

 

"Bioluminescent and spectroscopic properties of His-Trp-Tyr triad mutants of obelin and aequorin."

Photochem Photobiol Sci. 2013 Jun 21;12(6):1016-24.

Eremeeva EV, Markova SV, Frank LA, Visser AJ, van Berkel WJ, Vysotski ES.

Abstract:

Ca(2+)-regulated photoproteins are responsible for the bioluminescence of a
variety of marine organisms, mostly coelenterates. The photoproteins consist of　a single polypeptide chain to which an imidazopyrazinone derivative
(2-hydroperoxycoelenterazine) is tightly bound. According to photoprotein spatial structures the side chains of His175, Trp179, and Tyr190 in obelin and His169, Trp173, Tyr184 in aequorin are at distances that allow hydrogen bonding with the peroxide and carbonyl groups of the 2-hydroperoxycoelenterazine ligand. We replaced these amino acids in both photoproteins by residues with different hydrogen bond donor-acceptor capacity. All mutants exhibited luciferase-like bioluminescence activity, hardly present in the wild-type photoproteins, and showed low or no photoprotein activity, except for aeqH169Q (24% of wild-type activity), obeW179Y (23%), obeW179F (67%), obeY190F (14%), and aeqY184F (22%). The results clearly support the supposition made from photoprotein spatial structures that the hydrogen bond network formed by His-Trp-Tyr triad participates in stabilizing the 2-hydroperoxy adduct of coelenterazine. These residues are also essential for the positioning of the2-hydroperoxycoelenterazine intermediate, light emitting reaction, and for the formation of active photoprotein. In addition, we demonstrate that although the positions of His-Trp-Tyr residues in aequorin and obelin spatial structures are almost identical the substitution effects might be noticeably different.

 

いよいよシトクロムCオキシダーゼの登場（改訂版）

いよいよシトクロムc(Cyt c)オキシダーゼの登場

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図1　Cyt c（Cytochrome c）はナノレベルの電子の運び屋である（PDBID:2B4Z, R=1.5A）。Journal: (2008) Proteins70: 83-92

 

Cyt c（Cytochrome c）は 図1に示すようにナノレベルの電子の運び屋である。中心にあるFe-ヘムを蛋白が囲み、電子を運ぶ他の多くの蛋白質と同様、つかまえにくい電子を扱うのに特別な補欠分子族（prosthetic group）を持っている。cyt cは、図中では鉄イオンを含むヘム基（heme group）を内側に強くつかんで持っている。この鉄イオンは簡単に電子の取り込みと解放を行う（Fe3+⇔Fe2+）。そして周りの蛋白質は、どれだけしっかり電子をつかんでいるかを調整し、電子にとって完全な環境を作り出す。また、cyt cが細胞の電子回路全体におけるどの位置に当てはまるかについても決めている。

cyt cは古代よりある蛋白質で、生命進化の早い段階に発達した。この必須蛋白質は、細胞の動力生産において重要な段階を担っており、ここ数百万年の間ほとんど変化してこなかった。従って、酵母、植物、そして我々の細胞どれを探しても非常に似た型のcyt　cが見つかる。PDBを検索すると、他にも様々な電子運搬分子があることが分かる。cyt cには様々な変異があり、いずれも電子運搬にはヘムと鉄イオンを使うが、担当する仕事の違いに応じて電子を囲む蛋白質を変化させている。他の電子運搬体はまた別の補欠分子族を使って電子を運んでいる。そのような補欠分子族としては、フェレドキシン（ferredoxin）で使われている鉄硫黄クラスター（iron-sulfur cluster）や、アズリン（azurin）やプラストシアニン（plastocyanin）で使われる銅イオンのほか、より珍しい金属イオンを使ったものも存在する。cyt cのように、これらの蛋白質もそれぞれ単独で細胞電子回路に接続していて、ある地点から別の地点へ電子を運搬している。

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図2a　cyt c オキシダーゼ（１OCC）のサブユニットをchem3Dで拡大した図。ヘム骨格が2個垣間見える。

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図2b　cyt cオキシダーゼの活性中心における酸素分子の構造。PDBID:2Y69の酸素分子を中心にして、５A以内の隣接group を図示した（使用ソフトはCAChe）。

 

他方、Cyt c oxidaseは図2に示すようにいくつかの金属補欠分子族部位と13のタンパク質サブユニットから構成される巨大な内在性膜タンパク質である。10個のサブユニットは核由来で、残りの3個はミトコンドリアで合成される。cyt c oxidaseには2種のヘム（ヘムa 、ヘムa ₃）、2種の銅中心（Cu_AとCu_B）が含まれている。前者はサブユニットIに位置し、後者はサブユニットIIに配位している。サブユニットIのヘムa ₃とCu_Bはそれぞれで二核中心を形成し、酸素の還元部位となっている。cyt c は、複合体IIIのシトクロムc ₁によって還元された後、複合体IVのCu_A二核中心と結合し、cyt c の鉄中心はFe²⁺からFe³⁺に酸化される。還元されたCu_A二核中心はその電子をヘムa に送り、さらにそこからヘムa ₃-Cu_B二核中心に送られる。この二核中心の2個の金属イオンは4.5 Å離れており、十分な酸化状態の水酸化物イオンに配位している。cyt c の結晶学的研究では、Tyr(244)のC6とHis(240)のε-Nが結合するという独特な翻訳後修飾が見られる。これにより、ヘムa ₃-Cu_B二核中心が4電子を受け取って酸素分子を水に還元するという極めて重要な役割が可能になっている。

反応の概要をまとめると：

4 Fe²⁺-cyt c + 8 H⁺_in + O₂ → 4 Fe³⁺-cyt c + 2 H₂O + 4 H⁺_out

となる。まず、2個の電子がcyt cから、Cu_A二核中心とヘムa を通過して、ヘムa ₃-Cu_B二核中心に至り、このFe³⁺はFe²⁺に、Cu²⁺はCu⁺に還元される。このときそれぞれの金属イオンに配位していたヒドロキシル配位子はプロトン化されて水として失われ、金属間に酸素分子が入る空間が作られる。酸素はFe²⁺-cyt c由来の2電子により迅速に還元され、フェリオキソ型(Fe⁺⁴=O)に変換される。Cu_B側の酸素原子はCu⁺からの1電子と、約４Å離れたTyr(244)の由来の1電子と1プロトンを受け取り、ヒドロキシ配位子に変換される。このときTyr(244)はチロシルラジカルとなる。別のcyt c から発生する3番目の電子は始めの2種の電子キャリアーからヘムa ₃-Cu_Bに至り、この電子と2プロトンによりチロシルラジカルがチロシンに戻り、そしてヒドロキシドはCu_B²⁺に結合し後に水分子となる。同様に4番目の電子も始めの2種の電子キャリアーからヘムa ₃-Cu_Bに至ることによりFe⁺⁴=OがFe⁺³に還元され、同時に酸素原子がプロトンを受け取り、ヘムa ₃-Cu_Bがこのサイクルの始めの状態に戻る。まとめると、4分子の還元型cyt c と4個のプロトンが用いられ酸素分子を2分子の水に還元していることになる。

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図3　図1の活性中心における酸素分子とチロシン（Y244：図の左上）の配置。

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Protocatechuate 3,4-dioxygenase（改訂版）

プロトカテク酸-3,4-ジオキシゲナーゼ（protocatechuate 3,4-dioxygenase）は次の化学反応を触媒する酸素添加酵素で、基本的にはカテコール-2,3-ジオキシゲナーセと同じ反応である。

プロトカテク酸 + O₂  3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸

 反応式の通り、この酵素の基質はプロトカテク酸とO₂、生成物は3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸である。補因子として鉄(Fe3+)を用いる（図1,2参照）。ノンヘム鉄の周りは2個のイミダゾール残基、tyr残基と水分子、基質のプロトカテク酸と酸素分子（図には表れていない）によって反応場を構成する。

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図1　Catalytic cycle for extradiol cleavage。

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図2　プロトカテク酸-3,4-ジオキシゲナーゼ（PDBID: 3LMX）のFe中心の周りのアミノ酸残基と基質（半径4.5A 以内 ） (Purpero, V.M. , Lipscomb, J.D.　et al, to be published.)）。 

FUJISAWA H. et al, J. Biol.Chem. 247(13), 4414-4421 (1972). Protocatechuate 3,4-Dioxygenase II. ELECTRON SPIN RESONANCE AND SPECTRAL STUDIES OF INTERACTION OF SUBSTRATES AND ENZYME.

Summary
A concentrated solution of protocatechuate 3,4-dioxygenase has a deep red color with a broad absorption band between 400 and 650 nm. The enzyme showed a sharp electron spin resonance signal at g = 4.31 known to be due to the high spin state of ferric ion. The signal markedly decreased upon the addition of sodium dithionite concomitant with bleaching of the red color, but the signal as well as the red color was partially restored when the solution was exposed to air. The restoration of the red color was also observed when potassium ferricyanide was added to the solution under anaerobic conditions. These results indicate that the trivalent iron bound to the enzyme is responsible for the electron spin resonance signal as well as the visible
absorption spectrum of the enzyme. When the substrate, protoacatechuic acid, was added to the enzyme under anaerobic conditions, the electron spin
resonance signal at g = 4.31 decreased instantaneously. The signal was restored to the original level when the substrate was completely exhausted by the introduction of air.

The decrease in electron spin resonance signal was also observed when various substrate analogues or competitive inhibitors were used. However, changes in electron spin resonance signal caused by substrate analogues or competitive inhibitors were somewhat different from the one caused by the substrate in that they showed a marked anisotropy. The visible absorption spectrum of the enzyme exhibited an increase in absorbance with a slight red shift of the peak by the addition of the substrate under anaerobic conditions
indicating the possible formation of a enzyme-substrate complex. The spectrum was restored to the original one after the substrate was exhausted by the addition of oxygen. Similar, but not exactly identical spectral changes
were observed when various substrate analogues were used. The spectrum of the enzyme-substrate complex was markedly decreased when sodium dithionite was added to the complex and was restored to that of the complex upon the addition of ferricyanide. Further addition of oxygen converted the spectrum to that of the original enzyme. Evidence is also presented to indicate that the enzyme consists of eight subunits and combines with 8 moles of substrate.
In light of the above findings, the valence state of the iron in the enzyme, and its relation to substrate binding sites and to subunit structure of the enzyme are discussed.

（参考）Fujisawa H, Hayaishi O (1968). “Protocatechuate 3,4-dioxygenase. I. Crystallization and characterization”. J. Biol. Chem. 243 (10): 2673?8.PMID　496795

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敢て再論、環境浄化にカテコールジオキシゲナーゼ！

自然界では芳香族アミノ酸をはじめ難分解性のリグニンなどほとんどの芳香族化合物は土壌菌のモノオキシゲナーゼによってカテコール化合物へと代謝される。さらにカテコール-ジオキシゲナーゼによって芳香環は開裂され，ATP 産生系（解糖系やクエン酸回路）に合流する。多くの環境ホルモンを含む環境汚染物質も，その構造中にカテコール環をもつ。シグナル伝達物質の中にもカテコール誘導体であるものが知られている。O2 は酸素添加酵素の存在下でこれらの物質を代謝する。

反応1　カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼの反応によりカテコールからcis,cis-ムコン酸が生成する例。

カテコールジオキシゲナーゼ（catechol dioxygenases）は反応1に示すように、カテコール類を酸化的開裂させる金属タンパク質酵素群である。この酵素群は基質に酸素分子（O₂）を組み込む。1955年、早石等はO18を用いて、反応１を証明した。緑濃菌のカテコールジオキシゲナーゼは酸化還元酵素の一つで、カテコール-1,2-ジオキシゲナーゼ（PDBID:３HHY）、カテコール-2,3-ジオキシゲナーゼ（PDBID:３HPY）、およびプロトカテキン酸-3,4-ジオキシゲナーゼ（PDBID:３LMX）の3種類がある。カテコールジオキシゲナーゼの活性部位はだいたいは鉄を含む部分であるが、マンガンを含む型（PDBID:?）も知られている。

奇しくも、同年の1955年、ア メリカのH.Maisonはキノコのフェノラーゼという酵素がジメチルフェノールをカテコールに変える反応において、生成物中に取 り込まれる酸素が分子状酸素に由来することをO18を用いた実験で証明 した。

これらは、以前より知られていた酸素の働きとは異なる新 しい生体内反応であった。こ れ らの反応を触媒する酵素は酸素添加酵素(オ キシゲナーゼ)と呼ばれ、前者のような添加酵素をジオキシゲナーゼと呼び、後者をモノオキシゲナーゼと呼ぶ。こ れらの酵素は生体内の代謝機能に大きな役割を果たすほか、薬物・毒物・農薬などの外来性物質の代謝にも関与 し、解毒や環境浄化の観点からも注目を集めている。

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図１　カテコール１，２-ジオキシゲナーゼ結晶構造図（PDBID:３HHY）。Chem3Dで鉄原子近傍を示した図。ペプチドはcartoonで表示し、リガンドはヴァンデアワールス半径を基にspace fillingで表示した。中央にカテコールとノンヘム鉄原子が錯形成しているのが見える。

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図２　Fe3+活性中心の模型図（PDBID:３HHY）。CACheを用いて、鉄原子を中心に4Åの範囲に入るアミノ酸グループを選んだ。鉄原子はカテコールのOH-基酸素およびtyr138酸素３個とイミダゾール窒素２個の５個の元素で取り囲まれている。

　一方、　カタラーゼ反応、スーパオキシドジスムターゼ反応、抗生物質の合成、エチレン合成、フェニルアラニン・チロシン・プロリンの水酸化など、一見関係のない多彩な反応があるが、これらの反応を触媒する酵素が、２個のヒスチジン残基と１個のグルタミン酸（またはアスパラギン酸）残基に結合したFe2+イオンを共通して活性部位に持っている。この事実は、同じ非ヘム Fe2+ を持つカテコール2,3-ジオ

 

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図3　カテコール‐2,3-ヂオキシゲナーゼ（PDBID:３HPY）のFe2+の周り（5Å以内）の配位子

 

キシゲナーゼがコンポジット生体触媒になり得ることを示唆している。近年、同じ非ヘム Fe2+ を持つカテコール2,3-ジオキシゲナーゼに関する論文発表が相次いでおり、環境浄化の面から、やっと、ことの重大性が認識されだしたのである。ノーベル賞候補に挙げられて久しい。

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