大腸菌から単離された複合体IにおけるＦｅＳとセミキノンのESR信号詳細
JBC288, 20, 14310 (2013)
図1に示す単離複合体I試料のEPRスペクトル（8.28 mg / ml）は２核クラスタおよび4核クラスタ8種類が重畳する様子を示している。 同試料を嫌気6 mMのNADH（a）又は20mMのジチオナイト（b）で還元した。 EPRスペクトルは、40Kと2 mW（A）または13 Kと5 mW（B）で記録した。図には各FeSクラスターから生じるEPR信号の位置が示されている。
図1 単離複合体I試料のEPRスペクトル（8.28 mg / ml）。 同試料を嫌気6 mMのNADH（a）又は20mMのジチオン酸（b）で還元した。 EPRスペクトルは、40Kと2 mW（A）または13 Kと5 mW（B）で記録した。各FeSクラスターから生じるEPR信号の位置が示されている。他のEPR条件は、マイクロ波周波数、9.45 GHz、変調周波数、100 kHzで、振幅変調、0.6 mT。
信号強度はNADH還元とジチオナイト還元でほとんど同じである (Fig 1A(a) 、 (b))。 ４核クラスタN2, N3, N4のEPR 信号は二核錯体の信号が重畳し、複雑なスペクトルを示す。NADH還元とジチオナイト還元双方でも観測された（13K および 5 mW） (Fig. 1B)。これらのクラスタのgz値および線幅からは目立った相違は観測されなかった。しかし、gz = 2.05 、2.03,での信号強度およびgy ~1.94での信号強度はジチオナイト還元の方がNADH還元よりも目立って大きかった。NADH還元とジチオナイト還元での大腸菌複合体N6 信号における 6倍の違いは NADH還元ではできないがジチオナイト還元で出来るN7による信号が災いしている。 電子移動道から２０．５Åも離れているためである。 N6a、N6bは 歴史的にはESRサイレントであると信じられていた。 本研究で初めて、近くで 重なった信号であることが分かった。g = 2.099 信号は204 mW では1.2 mWよりも目立って強い信号を示した 。これは緩和時間が速いことを示す。逆に、 g = 2.086 信号は1.2 mW で大きく、204 mWで小さい。 81 mW での差スペクトルでは２本のピークがある。N4に加えて、N6aが複合体１に存在することを強く示している。Yano 等は P. denitrificans Nqo9 ( E. coli NuoI 同族体) にあるサブユニットでN6a ,N6bの外側対は gz,x = 2.08、 1.89 で、内側対はgz,x = 2.05、 1.92であることを示した。 14 Kで外側対は緩和が速く(P1/2= 342 mW)、内側対は (P1/2 = 8 mW) であった。 g = 2.099信号をN6aと 同定してg = 2.086 をN4 と同定した。 N6bからくる内側対の信号 gzはN2のそれと完全に重畳した。そこで、異なる温度、異なるMW電力、さらに、シム法を併用して解析を挙行した。複合体ⅠのFeSクラスタの還元レベルはジチオナイトの方がNADH還元より大きかった。 20K、5 mW (Fig. 6)で差ESRスペクトルで４核クラスタの寄与を決定した。又、差スペクトルで他の４核クラスタの寄与を最小にするためでもある。20K, 5 mW でN2は十分還元されることを信用して ジチオナイト還元、NADH還元、さらに差スペクトルをそれぞれシムレートした。用いたg値は表1に示されている。
表１ シム解析に使用した複合体1ESR信号のg値
ESR信号 gx gy gz
N1a 1.922 1.953 2.000
N1b 1.934 1.942 2.027
N2 1.903 1.903 2.050
N3 1.885 1.939 2.027
N4 1.894 1.940 2.088
N6a 1.895 1.935 2.093
N6b 1.939 1.939 2.048
N7 1.900 1.941 2.049
差スペクトルで余分のESR信号が現れた： g = 2.05、 1.93の信号である。これはN3 (gz,y,x = 2.03, 1.94, 1.88, Fig. 6B (a)), N4 (gz,y,x = 2.09, 1.94, 1.89, Fig. 6B (b)) およびN7(gz,y,x = 2.05, 1.94, 1.90, Fig. 6B (a))でもシムできなかった。これは厳密な嫌気条件で還元して出来るN6bが存在することを強く示唆している。それの性質はN2信号の性質とは全く逆で、好気的でNADHでも完全に還元される。しかし、N2 およびN6b 信号は 軸対象で高温でも観測できる。スペクトル Fig. 6B(c), (赤線) はN6の軸対象ESRシムを示している。これはN2のgz値と重なる。
図２. (A) dithionite (a) またはNADH (b) で還元された複合体1のＥＳＲスペクトルとシム合成。ジチオナイト還元とＮＡＤＨ還元の差スペクトル (c) 。スペクトルは 20K、5 mW測定。点線はここのＦｅＳの和を示す。 (B) 4核クラスタのシムスペクトル。
セミキノン信号
精製した大腸菌複合体Ⅰのセミキノン信号SQ信号は他の研究室で検出されたことはなかったが、我々が始めて20Kで検出に成功した (図 3A(a), g = 2.00 領域参照)。このg = 2.005 SQ信号のMW電力特性を150Kで調べた。150KでもN1aのgz = 2.00成分が残りSQ信号と重畳した。それで、SQ信号を分離する為に差スペクトルを取った。 さいわい、完全にN1a は軽減された。 一方、ジチオナイト還元ではSQ信号が消えた(図3(c))。結局、大腸菌複合体1のSQ信号の分離に成功した(図3, 上右)。線幅 (ΔHpp) ~12 Gで,中性セミキノン構造 (QH?) を示している。一般に、余分のプロトン化はキノン環のスピン密度が非対称の摂動のために線幅が増加することが知られている。MW電力飽和解析を行うと、P1/2 = 1.85 mWでは、単一信号として90% 以上であることがわかった。ΔHpp >15G の信号＝フラボSQ成分は存在しなかった。複合体Ⅰが電位差滴定で還元されたとき 、フラボSQ成分のΔHppは大体 24Gであった。 さらに。ascimicin (100 μM)存在下ではSQ 信号は６０％ に 減少している (図3 (b))。 このSQ信号は複合体1における酸化還元と結合したプロトン汲み上げ機構に関与していると思われる。
図３ （左）、単離複合体IのEPRスペクトル。EPRスペクトルは、150 K、1.2 mWで記録した。複合体I（15μM）のascimicin（強力な大腸菌の阻害剤）不在下（a）、存在下（b）でNADHで還元した（c）は、ジチオン酸塩で還元した。（右）、ascimicinの不在（d）又は存在（e）におけるNADH還元－ジチオン還元スペクトルの差スペクトル。 二核クラスタ、N1a とN1b のEPR信号は 40K、2 mW で観測された.
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