kahoの日記で有名になった「kaho」さんこと、遠藤高帆さんのSTAP反証論文Quality control method for RNA-seq using single nucleotide polymorphism allele frequencyが本日Genes to Cellsにでていた。STAPの反証論文としては初めてのものである(*)
ちょっと読んでみると、主にRNA-seqデーターを基に、解析を行っており、以前kahoの日記で有名になったChip-seqのインプットのデーターを基にした解析の話はでていなかった。
Chip-seqの解析はちょっと雑な感じもしたので、kahoさんの方で詰めきれなかったことがあったのだろうか。また不可思議なのは、以前NCBIにdepositしてあったChip-seqデータ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/?term=SAMN02393426+OR+SAMN02393427+OR+SAMN02393428+OR+SAMN02393429+OR+SAMN02393430+OR+SAMN02393431+OR+SAMN02393432+OR+SAMN02393433+OR+SAMN02393434+OR+SAMN02393435)は今見れなくなっている。元論文自体リトラクトされたからその影響とも取れるのですが、置いておくとまずいことでもあったのかもしれない(**)。
論文の趣旨としては、RNA-seqに利用されている細胞のジェノタイプが129/B6のF1であることに着目して、129とB6とで配列のことなるSNPに着目し、129とB6由来の染色体アリルの混ざりぐあいを調べる(129B6F1なので本来は50％)手法を基にして、次のことを見出している。
1）ES,STAP,STAP-SCはdepositデーターのアノテーション通り129B6F1由来、FI-SCはアノテーションでは129B6F1であるが、ほとんどがB6由来の細胞であると考えられる。
2）FI-TSCは一部の遺伝子はCD1由来のSNPを持ち、その他の遺伝子に関してはB6由来のSNPをもつ。ES（B6)+TSC（CD1)といった混ざりものの細胞ではないのか？
3）STAP細胞については、ゲノム全体では129由来のアリルとB6由来のアリルの半々が混ざっているが、8番染色体に反してはB6由来のアリルが30％しか占めていない。8番染色体のトリソミーが示唆される。
4)各種遺伝子の発現ES細胞とSTAP細胞とで比べると8番染色体由来の遺伝子の発現がSTAP細胞で優位に多く、13番染色体由来の遺伝子の発現がSTAP細胞で少ない。このことからも8番染色体の数の増加、13番染色体の欠失が疑われる。
5）8番染色体はマウスの培養したES細胞に多い変異であり、STAP細胞はES細胞+体細胞の混ざったものであることが考えられる。
6）8番染色体の異常のあるES細胞はマウス個体をつくらないので、このことからもSTAP細胞よりマウス個体がつくれるSTAP幹細胞ができたというのは疑わしい。
といったことになる。
以前この研究に関する報道をうけて考察したものづくりのための研究ノート043：STAP細胞＝ES細胞でない？？「kahoの日記」の意外な結末!!でのべていたように
結局STAP細胞＆STAP関連細胞の系統としては
１）ES細胞単独
２）ES+TS細胞
３）ES+体細胞
の３つがあるのかもしれない。少なくとも２）、３）の系統はあることがこの論文からは示唆される。
すると気になるは、ES細胞やTS細胞のソースはどこ？？コンタミは意図的？？ということではないだろうか？
細胞の供給者というか、事情を知りすぎた人物がいるのではないか？(***)
(*)生物学的な反証論文というのもそろそろ出そうという噂である。こんなこともあるから当初1年かかるとしていた再現実験も、11月までが目安なのだろうか？
(**）よくよくみるとSRP038104にまとめられておりました。。（10月21日追記）
(***）単独犯ではない？！これ以上は憶測になるので、書けませんね。
(10月8日追記）
トリソミー8はマウスのMDS細胞由来で、ES由来は否定できるはないかという話もでているようであるが、
１）いくらB6でも新生児マウスでMDSはそんなにおらんやろう。普通に使うadultでもそんなに見たことはない（月齢12か月とかでない限り、そんなに頻発しないのでは？）。
２）マウス由来でそれがたまたまMDSであったとしても、その後培養できないし、マウスの個体はつくれんやろう
とあまり説得力がない。
現実的には、状況証拠的なこのバイオインフォの結果だけでなく、近々出るという生物学的な反証論文も含めて、最終的には総合的に判断するということになるのだろう。
（追記）2016年3月1日追記。
個人的にはもはや興味を失っていたのだけれど、未だにこのブログのSTAP関連の項目を目にされている方が多い様なので、追記しておく。
2015年9月24日同様の趣旨からなる論文をNatureが掲載した。
１報目"Failure to replicate the STAP cell phenomenon"はボストンを中心とした幹細胞分野の大御所たちのチームによるもの
２報目"STAP cells are derived from ES cells"は理研のグループによるもの
の二つで、１はほぼ全てのSTAPのprotocolを検証し、作成できないことを示すとともに、バイオインフォマテッィクスを利用してSTAP細胞とされていたものに、ESが混ざっていることを証明したもの、２もバイオインフォマティックスを用いてESのまざりを証明したものである。
STAPの論文は途中から基本的に無理筋な感じを呈してきたが、これで完全に決着がついた。残念ながら、おそらく誰かがES細胞を混ぜて虚構の細胞を作ったことになる（結局それが誰かわからないのであるが。。）。ただこの一件で日本のサイエンスに大きな傷跡が残り、一人の偉大な科学者を失ったことは悔やまれる。
ちょっと読んでみると、主にRNA-seqデーターを基に、解析を行っており、以前kahoの日記で有名になったChip-seqのインプットのデーターを基にした解析の話はでていなかった。
Chip-seqの解析はちょっと雑な感じもしたので、kahoさんの方で詰めきれなかったことがあったのだろうか。また不可思議なのは、以前NCBIにdepositしてあったChip-seqデータ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/?term=SAMN02393426+OR+SAMN02393427+OR+SAMN02393428+OR+SAMN02393429+OR+SAMN02393430+OR+SAMN02393431+OR+SAMN02393432+OR+SAMN02393433+OR+SAMN02393434+OR+SAMN02393435)は今見れなくなっている。元論文自体リトラクトされたからその影響とも取れるのですが、置いておくとまずいことでもあったのかもしれない(**)。
論文の趣旨としては、RNA-seqに利用されている細胞のジェノタイプが129/B6のF1であることに着目して、129とB6とで配列のことなるSNPに着目し、129とB6由来の染色体アリルの混ざりぐあいを調べる(129B6F1なので本来は50％)手法を基にして、次のことを見出している。
1）ES,STAP,STAP-SCはdepositデーターのアノテーション通り129B6F1由来、FI-SCはアノテーションでは129B6F1であるが、ほとんどがB6由来の細胞であると考えられる。
2）FI-TSCは一部の遺伝子はCD1由来のSNPを持ち、その他の遺伝子に関してはB6由来のSNPをもつ。ES（B6)+TSC（CD1)といった混ざりものの細胞ではないのか？
3）STAP細胞については、ゲノム全体では129由来のアリルとB6由来のアリルの半々が混ざっているが、8番染色体に反してはB6由来のアリルが30％しか占めていない。8番染色体のトリソミーが示唆される。
4)各種遺伝子の発現ES細胞とSTAP細胞とで比べると8番染色体由来の遺伝子の発現がSTAP細胞で優位に多く、13番染色体由来の遺伝子の発現がSTAP細胞で少ない。このことからも8番染色体の数の増加、13番染色体の欠失が疑われる。
5）8番染色体はマウスの培養したES細胞に多い変異であり、STAP細胞はES細胞+体細胞の混ざったものであることが考えられる。
6）8番染色体の異常のあるES細胞はマウス個体をつくらないので、このことからもSTAP細胞よりマウス個体がつくれるSTAP幹細胞ができたというのは疑わしい。
といったことになる。
以前この研究に関する報道をうけて考察したものづくりのための研究ノート043：STAP細胞＝ES細胞でない？？「kahoの日記」の意外な結末!!でのべていたように
結局STAP細胞＆STAP関連細胞の系統としては
１）ES細胞単独
２）ES+TS細胞
３）ES+体細胞
の３つがあるのかもしれない。少なくとも２）、３）の系統はあることがこの論文からは示唆される。
すると気になるは、ES細胞やTS細胞のソースはどこ？？コンタミは意図的？？ということではないだろうか？
細胞の供給者というか、事情を知りすぎた人物がいるのではないか？(***)
(*)生物学的な反証論文というのもそろそろ出そうという噂である。こんなこともあるから当初1年かかるとしていた再現実験も、11月までが目安なのだろうか？
(**）よくよくみるとSRP038104にまとめられておりました。。（10月21日追記）
(***）単独犯ではない？！これ以上は憶測になるので、書けませんね。
(10月8日追記）
トリソミー8はマウスのMDS細胞由来で、ES由来は否定できるはないかという話もでているようであるが、
１）いくらB6でも新生児マウスでMDSはそんなにおらんやろう。普通に使うadultでもそんなに見たことはない（月齢12か月とかでない限り、そんなに頻発しないのでは？）。
２）マウス由来でそれがたまたまMDSであったとしても、その後培養できないし、マウスの個体はつくれんやろう
とあまり説得力がない。
現実的には、状況証拠的なこのバイオインフォの結果だけでなく、近々出るという生物学的な反証論文も含めて、最終的には総合的に判断するということになるのだろう。
（追記）2016年3月1日追記。
個人的にはもはや興味を失っていたのだけれど、未だにこのブログのSTAP関連の項目を目にされている方が多い様なので、追記しておく。
2015年9月24日同様の趣旨からなる論文をNatureが掲載した。
１報目"Failure to replicate the STAP cell phenomenon"はボストンを中心とした幹細胞分野の大御所たちのチームによるもの
２報目"STAP cells are derived from ES cells"は理研のグループによるもの
の二つで、１はほぼ全てのSTAPのprotocolを検証し、作成できないことを示すとともに、バイオインフォマテッィクスを利用してSTAP細胞とされていたものに、ESが混ざっていることを証明したもの、２もバイオインフォマティックスを用いてESのまざりを証明したものである。
STAPの論文は途中から基本的に無理筋な感じを呈してきたが、これで完全に決着がついた。残念ながら、おそらく誰かがES細胞を混ぜて虚構の細胞を作ったことになる（結局それが誰かわからないのであるが。。）。ただこの一件で日本のサイエンスに大きな傷跡が残り、一人の偉大な科学者を失ったことは悔やまれる。
小保方さんの手記の出版で、又スタップ細胞論文の事が話題になり、関心を持ちました。
stwatch さんのコメントはさすが専門家のご意見と、感心するばかりです。
これからも楽しみにしております。
ブログ後で拝見してみます！
１報目"Failure to replicate the STAP cell phenomenon"は、結論からあまり読んでおりません。ただ、内容的にHclではなく、ATPを試みた結果は載ってませんでした。一応少しやってるみたいですが。取り下げられた論文の本筋はATPが鍵だったとのこと。（手記より）（新証言が多々出てきました。）
２報目"STAP cells are derived from ES cellsについては、理研の調査報告書とともに「一研究者・教育者の意見」ブログにて、他の方と考察を重ねました。ハンドルネームは事情によりTs.Markerに変更しております。ちょっと待ってみたいな項目をメモブログに重ねております。宜しければご意見を賜ればと。（トリソミーについても最近追加いたしました）
http://blogs.yahoo.co.jp/p2_xx_p
昔のブログ記事に興味を持っていただいてありがとうございます。残念ながら私は熱が冷めてしまって、あのあとフォローしていません。キンガ論文はMuse cellのなり腐しみたいな感じなのでしょうか？これまた再現がとりにくそうですね。
基本的には
１）STAPに関しては元論文に信用できる部分が皆無、
２）複数のラボが再現に失敗ということ
二つの点からちょっと信じがたい、百歩譲ってそういう現象があるとしても、再現取りづらいということでしょうね。
残念ながら以上のような理由で、 STAPは今後の将来を担うもの技術とはなりようがなく、リプログラミングするならオーソドックスな山中ファクターでいいのではないかというのが、現場の技術者の感想ですね。
あとリプログラミング自体もう一時期のブームが去った感がありますね。今のブームはゲノム編集でしょうか？それも熱が冷めた理由ですね。
もしご興味があるならNatureの反証論文もお読みになってご自身で検討されることをお勧めします！
手記「あの日」は、読まれましたか。また、盛り上がってきましたよ。昨年年末には、キンガ論文もでました。
（http://www.nature.com/articles/srep17355）
マウスの対応表(http://www.nikkei-science.com/wp-content/uploads/2014/10/201412STAP.gif)については、紹介いただいたサイトの孫引きで、日経サイエンスのサイト(http://www.nikkei-science.com/201412_034.html)にでていましたね。
よくこんなの同定したなという感じです。
こちらのサイトは専門的で難しいですが、御纏めになっております。
（http://joodandesho.blogspot.jp/）
ノックインじゃないんだ。。よくこんな複雑なマウスのRNAseqから、GFPの上流が同定できるなあと思います。
いやはや、手に負えないくらい複雑な感じになってきましたね。すると、CHIP-seqとRNA-seqのFI-SCは由来が違うサンプルなのか？
少なくともデータベースに載っているサンプルとの、誰か対応表を作ってほしいところです。
あと個人的には、RNAseqのサンプルから外来遺伝子のプロモーターというか上流を、推定できるんだっていう点が勉強になりますね（もともとある遺伝子なら、リファエンスゲノムと比較すれば、プロモーターが大体推定できるでしょうが。。）
アクロシンGFPはノックインだからmRNAのnon coding領域にアクロシン遺伝子の一部の配列が含まれているということなのか？CAG-GFPのような場合どこに入っているかRNA-seqで推定できるのか？
まだまだ素人的にはRNA-seqは勉強できるところが多そうです。
樹立時期
FLS１ 2012年1月31日 アクロシン
FLS2～8 2012年2月2日 アクロシン
FLS-T１、T2 2013年2月22日 18番アクロシンなし？
AC129-1，2 2013年8月13日 18番アクロシンし？
なのでアクロシン入り（マウスかES)は2012年頃まで。
資料が載ってない分（多分記者会見）
「遠藤氏によるその後の解析で，Tru-seqで調べたSTAP幹細胞と，ChiP-seqを取ったFI幹細胞はともに129とB6を交配したマウスの細胞で，Acr-GFP遺伝子が入っていることがわかった。若山氏とCDBが公表したSTAP幹細胞と特徴が一致。」
複雑すぎます。
このあたりのマウスもまたデポジットのデータのサンプル混ざっていると、Ｎａｔｕｒｅ論文のデータの議論できなくなります。理研なのにマウスのストレイン管理はいい加減だったという話が残念な話で終わるだけかもしれませんね。
おっしゃるように、そしてブロにも少し書いたように、kaho論文自体は、状況証拠的なものでしかありません。さらに元のサンプルの記載ミスの可能性、バッククロス不全の問題まで議論しないといけなくなると、手法上の限界はあると思います。ただ今後ＮＧＳ関連のデーターが充実してくる中で、kahoさんのようなＱＣの手法はいろいろと出てくるだろうし、発表された実験の是非についても議論する手法の一つにはなるだろうなと思っています。
ご興味がおありの、実際のＳＴＡＰの是非については、近々でるという生物学的な反証（リトラクト論文になんででるのか？という話もありますが）とともに、総合的に判断するということでしょうね。
CDBに保全されているSTAP関連細胞株に関する検証について（7月22日訂正）
http://www.riken.jp/pr/topics/2014/20140616_2/
0％付近に少しは何かでませんか。（FI-SC)
CD1細胞が混入しているか否か。
この点が論文を読んでも雰囲気しかわからないです。
それがあっているとすると（またここでCHIP-seqとRNA-seqを別の細胞をつかっているのではという突っ込みも入り得ますが、その辺もそうでないと仮定すると）、デポジットのFI-SCは、やはりB6マウス由来なんだろうな。TSもOct4-GFPだったのだろうか？個人的にはTS（CD1)はCAG-GFPだったのではと思っています。
ESの混ざりかどうかは別として、少なくともSTAP-SC以降は細胞数は確保できるだろうから、STAP-SCとFI-SCは同じ系統のマウスで、できれば同じロットの細胞でRNA-seqすべきだったでしょうね。FI-SCの系統名が記載ミスであったとしても、いろいろ突っ込まれても仕方ない部分でしょうね。
http://1tamachan.blog31.fc2.com/blog-entry-11096.html
「・ 論文中では割愛したが、細胞を緑に光らせるGFPを高発現しており、その配列から細胞初期化の指標となるOct4発現時に細胞が緑に光るOct4-GFP が入った細胞を用いていたことが推定される。また、TS細胞は一連の実験で比較対照用に使用されていたTS細胞と同じ系統のマウス（CD1）から得たもの と推定される。」
と言っていたそうです。
「若山博士は129マウス(Chr18-GFP)のねずみを数代バッククロスして作ったので、どうもところどころB6マウスの遺伝子が残ってしまっているようです。それが解析結果に影響を与えているのかもしれません。」
（http://radiation-japan.info/journal/science/stem_sell/stap-cell8.html）
とあります。
129/sv －＞129B6バッククロス不十分（129B6F3-4?）
129B6F1－＞129/ｓｖ（129B6F3-4） X B6F1
てな感じでしょうかね。データベースの記載とのkaho論文の分析＆記述の矛盾はここらへんにあるのかもしれませんね。CD-1もバッククロス不十分とかありそうだな。。
別の観点からの指摘に、御本人の書き込みがあるブログを読みました。（昨日）
http://blog.livedoor.jp/pyridoxal_phosphate/archives/15536754.html#comments
直接、本人が書き込んでくるとはびっくりです。
リトラクトされた論文だからしょうがないのかもですが、元論文は、ミスも多く、変な点が多すぎるのも問題ですね。データベースの記載ミスとかやめてほしい。そこまで考えないといけないとなると、頭がくらくらします。
kahoさんもこの辺りを論文で触れなかったのは意味があるのでしょうね。
生物学的な反証論文が出るとの話もありますから、それも含めて総合的に判断していくのが、賢いあり方なのかもしれません。
今は見れませんが、以前理研が出していたSTAP詳細プロトコールに以下のような記述がありました（確か私もちょっと書いてましたね（http://blog.goo.ne.jp/maromato2012/e/29d7c4e4e18caa192b6a9c058c23c3a4））。
We tested the following three different genetic backgrounds of mice for STAP stem cell establishment from STAP cell clusters, and observed reproducible establishment: C57BL/6 carrying Oct4-gfp(29 of 29), 129/Sv carryingcc Rosa26-gfp(2 of 2), and 129/Sv×C57BL/6 carrying cag-gfp(12 of 16)
なおこの情報からすると、ご指摘のように、データーベース上のFI-SCの由来がB6・129でなく、B6ということが真実なら、CAGのシーケンスがないのかなと思います。
もしご興味があれば、CAG, GFP, RFPあたりで、RNA-seqのunmapped sequenceをマッピングして、CAGの有無をみてはいかがでしょうか？PCがある程度のスペックがあれば、手持ちのPCを使って、以下のような手法で意外と簡単にできると思います。しっかりやるには、ポジコン。ネガコンを用意して、計算量が多くなるので、めんどくさいのは確かですが。。
http://d.hatena.ne.jp/biochem_fan/20140306/139412
http://blog.goo.ne.jp/maromato2012/e/3f0ee9aefe21c14aec0d0a2a9cceefa0
Sample: SAMN02393427 • Generic sample from Mus musculus (less...)
Organism: Mus musculus
Attributes:
strain: 129/sv
development stage: Epi stem cells
sample type: RNA-seq
label: Epi stem cell RNA-seq
もとのnature論文が結構いい加減なデータ管理になっていたので、ご指摘のように、データベースの情報にも記載ミスがある可能性については、ゼロではないと思います。
また、以下のブログではGOF(B6)の記載もあり、B6のSTAP-SCが存在し、B6のFI-SCの存在も予想されます。
http://jupiter-press.doorblog.jp/archives/40654238.html
FigS1は、直感的には、non B6型ホモ、B6/non B6型へテロ、B6型ホモのアリルの割合をしめしたものなので、0, 50%, 100%の3ポイントからなるdiscreteなグラフとして考えるべきだと思います。
ここで重要なのは、０％のピークです。B6・129はF1（元論文でということになっています）なので、０％のピークがでません。
０％のピークがあるということは、nonB6型ホモのアリルということ、すなわち、B6とは別の系統のマウスか、B6と別の系統のマウスとのヘテロマウスならF2移行の世代のマウス（Fig1のNF, CAFはB6XBalB/cですが、3ライン掛け合わせなので、普通のF1ではない感じのようですね）だと思います。
EpiSCと似ているというのはあながち間違った意見ではなくて、129/svというストレインなので、0％のピークがあるからです。
ポジコンがないのでなんともいえませんが、以上からTSはCD-1でよいのかなと思います。
またFI_SCはES（B6)＋TS(CD-1)の混ざり物というのがkahoさんの主張だったのですが、Fig1,4での主張のようにほとんどがES由来の細胞であるという主張なので、一応議論は成立しているのだと思います。
トリソミーの件も1.5倍以上の結果、または129側からの解析結果が示されないとちょっと弱いと結論と思われます。
あとFig2はTSのオリジンについては何も言ってないんじゃないかなとおもっています。
２Dを言われているのだと思いますが、これはたとえばB6がA、１２９がTのSNPがあった時に、AA型（B6homo型) AT型（１２９B6hetero型)、TT型（１２９homo型)と分けられると思いますが、いくつかの遺伝子を見たときに、B6homo型, 129B6hetero型,129homo型の割合がどうなのかみただけのグラフだと思います。なのでexplicit
にTSのオリジンを述べているデーターではない気がしております。
ただこのグラフ、基本的に、三分類でその他というところがなく、CD1でまったく違うタイプのSNPた上の例でとえばGとかがあった場合がなぜ含まれていないのかという疑問は残りますが。。
若山研ではTSを129B6から作成しコントロールとして使用していたとのことなので、ひょっとしてstrainの登録ミスかと疑ってしまいました。129B6だとしたらFig4はありえませんか。
Sample: SAMN02393429 • Generic sample from Mus musculus (less...)
Organism: Mus musculus
Attributes:
strain: CD1
development stage: Trophoblast stem cells
sample type: RNA-seq
label: TS cell RNA-seq
あとTSは、小保方さんたちがdepositしていたものが、CD1とされています(SRP038104参照)。
念のためアノテーションを引用しておくと以下のようなです。
Sample: SAMN02393453 • Generic sample from Mus musculus (less...)
Organism: Mus musculus
Attributes:
strain: CD1
development stage: Trophoblast stem cells
sample type: ChIPSeq
label: TS_H3K4me3_ChIPSeq
129B6のように見える。別にCD1と比較したのかな？