PCR検査について現場臨床検査技師の声

PCR検査について、ネットで現場で働いている臨床検査技師の方の話をそのまま掲載します。
「新型コロナウイルスのPCR検査が「偽陰性」となる原因は？
柳田絵美衣 | 臨床検査技師（ゲノム・病理検査）、国際細胞検査士 4/7(火) 7:30
新型コロナウイルス感染数が日に日に増加しており、人々の不安は増すばかりである。
PCR検査件数を増やすには、検査要員の育成が必要である旨を以前、提言した。
新型コロナウイルス検査 次の課題は「検査要員の育成」（柳田絵美衣）
PCR検査の必要性が日々叫ばれている。しかしそんな中、検査結果に関する記事を目にするようになった。
西日本新聞　「陰性の人からコロナ感染か　大分県の男性」
西日本新聞　「陰性」者から感染か 　大分県「菌消滅後に検査の可能性」
■「陰性」と判定された人からの感染する理由は？
その理由として様々なことが考えられる。
新型コロナウイルスについては、未知な部分も多い。感度が良いとされるPCR検査でも捉えられないほどの微量なウイルス量でも、人に感染する可能性があるのだろうか？それとも、今回採取した検体の中にはウイルスが含まれていなかったのだろうか？
それとも、本来は陽性となるべき「感染者」が「陰性」となった「偽陰性」だったのだろうか？
本記事では、PCR検査で「偽陰性」となる原因について掘り下げたい。
■PCR検査は何をする？
DNAやRNAは目に見えず、非常に小さな物質であるため、その存在を確認するには、ある程度の量が必要となる。そのため、量を増やす工程である「増幅」を行うのだ。この方法がPCR（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）であり、微量のDNA断片を増幅して検出する方法である。
（以前の記事で解説しているがRNAウイルスである新型コロナウイルスは、「採取された検体に含まれるRNAをDNAに変換」→「そのDNAを増幅」の工程となる。）
新型コロナウイルス検査　「PCR検査」と「抗体検査キット」の違いは？　（柳田絵美衣）
◆PCRの原理
DNAは２本が、らせん状にねじれ合って存在している。PCRでは、
1.　まずこの２本のDNAを１本ずつに解く。（「変性」という工程）

2.　それぞれ１本になったDNAに「プライマー」と呼ばれる物質を結合させる。（「アニーリング」と呼ばれる工程）

3.　プライマーがDNAに相補的に伸びていく。（「伸長」という工程）
4.　もともと２本だったDNAは４本になる。

5.　この４本のDNAを用いて、同じ工程（変性、アニーリング、伸長）を行う。
6.　もともと４本だったDNAは８本になる。

この操作を繰り返すことで、DNAを増やすことができる。

そして、PCRの工程が完了したものの中に、増幅したDNAが存在するのかを確認する。
採取された検体の中に新型コロナウイルスのRNAが含まれていれば、RNAから変換されたDNAが増幅されて陽性となり、検体の中にRNAが含まれていなければ何も増幅されないので陰性となるのだ。
■PCR検査において正確な結果を出すためには
PCR検査において正確な結果を出すためには、多くの条件をクリアする必要があるのだ。

重要なポイントについて挙げる。

これでも、ほんの一部である。これらをふまえて「偽陰性となる原因」を解説していく。
■「偽陰性」となる原因はどこにあるのか？
「偽陰性」となる原因は、検査の一連の全工程において存在するのだ。
新型コロナウイルスだけではなく、一般のPCR検査において考えられる「偽陰性」の原因を一部挙げる。
■検体に関する原因
・検体を正しく採取できているのか
前回の記事新型コロナウイルス検査　「PCR検査」と「抗体検査キット」の違いは？　（柳田絵美衣）でも示したが、図のように正しい部位から検体が採取できており、かつ十分な量の検体を採取できなければ、正しいデータは得られず「偽陰性」となる場合もある。

■核酸（DNAやRNA）の抽出に関する原因
・検体から抽出したDNA・RNAの品質は良いか
検体（ぬぐい液）からDNAやRNAを抽出するのだが、DNAやRNA以外の不要な物質が混ざっていたり、操作中にDNAやRNAをロスしていると、正しいデータは得られず「偽陰性」となる場合もある。
■RNAの性質に関する原因
・RNAを正しく取り扱っているのか
RNAはDNAよりも不安定な性質であり、分解されやすい性質である。

我々のだ液や汗、空気中のホコリなどの中にはRNAを分解する物質が含まれている。そのために、RNAを取り扱うときは、適切な設備や器具が必要となる。さらに、RNAは低温で取扱う必要がある。つまり、RNAを正しく取り扱わなくては分解されてしまい、正しいデータは得られず「偽陰性」となる場合もある。
■PCR操作に関する原因
・PCRは適切な条件で行われているのか
PCRは様々な反応条件によって行われる。使用する試薬の量や濃度、プライマーの設計（精度に関わる）、反応の温度や時間、加える検体の量や濃度など、反応自体に関わる条件。さらに、室温や湿度や機械の電圧の安定性、使用する機械ごとの精度の差、試薬のロットごとの精度の差など、試薬や機器の精度も大きく影響を与える。加えて、「不要なものがコンタミネーションしていないか」や「技術者の能力差」などの条件も影響する。
■検査の精度管理に関する原因
・検査の精度管理は行われているのか
新型コロナウイルスのPCR検査は始まって間もないため、新型コロナウイルス用の試薬（プライマー）の精度は良いのか、PCRの反応条件が適切なのか、さらに検査する技術者はこの検査を正確に行えているのかが検査結果に影響を与えている可能性がある。
それ以外に、検体が正しく採取され、正しく保管され、正しく輸送されているのかの管理も重要である。
これら「検査の精度」は、様々な方法で管理され、一定の精度で検査される必要がある。
精度管理の一つとして「コントロール」となる物質を検体とともに検査し、「この検査は正しくおこなわれたのか？」を確かめる必要がある。

コントロールは「必ず陽性となるサンプル」「必ず陰性となるサンプル」であり、これを用いることで、「陽性となるべきものが陽性として結果が出るか」「陰性となるべきものが陰性として結果が出るか」を確かめる目的を持つ。しかし、ある施設では、これらのコントロールを用いていない。それによる「偽陰性」や「偽陽性」が起きているのではないかとも言われている。
■その他の原因
まだまだ考えられる原因は存在する。実は、ちょっとしたことでも偽陰性と誘導することもある。例えば、「過剰な滅菌・ウイルス除去」が原因な事例もある。他の検体や他の菌・ウイルスがコンタミネーション（混入）しないように、検査をする前にアルコールや次亜塩素酸で実験台や器具などを拭く。このとき、次亜塩素酸の濃度が高すぎる場合や、実験台や器具が次亜塩素酸の液体がびちゃびちゃの状態なまま使用した場合など、検体のウイルス自体が除去されてしまい陰性化してしまう可能性があるのだ。
■検査に関わる人たちは奮闘している
複雑な検査は、それだけ多くの条件決定が必要となり、それだけ偽陽性や偽陰性となる原因も増える。もちろん、検査技術の難易度も上がり、技術者に要求される技術は高くなる。だからこそ、冒頭で述べたように「人材の育成」が必須なのである。試薬や機器の精度も求められる。
新型コロナウイルス感染症が発生してまだ間もない。そのため、新型コロナウイルスに対する検査も始まったばかり。検査法はこれからまだまだ改善の余地があると言える。もちろん、現段階で検査結果に関する疑問（検査で陰性の判定であった人からの感染など）は、まだ知られていない新型コロナウイルスの持つ性質が関係しており、疑問解決の鍵となることは間違いないだろう。
現在、検査キットや試薬の開発をしている研究所や大学、検査キットの輸入をしている企業、そして、我々のように遺伝子検査や微生物検査を行う臨床検査技師などの技術者は、この状況を何とか打破したいと奮闘している。今後、検査の精度が更に高まっていくことや、新たな検査法が開発され、普及するだろう。「その時」は、もうすぐそこまで来ている。
新型コロナウイルス感染の対策として、外出の自粛やマスクの着用と手洗いなど、日本中・・・世界中の人々が我慢と努力を継続している。
我々、医療従事者もみなさんと共に闘っている。少しでも早く、この状況を打破できるように。 」