# 思い切り業界ネタですのであしからず
現在、構築中の酵素遺伝子発現系。単純にlacプロモーター直下に繋いだものは、どうも漏れが激しくてE. coliがどうにも嫌がるらしくて、一切構築物が得られず…
。仕方がないので、漏れの少ないpET系に秘密兵器のIn-Fusionキット(# 実は秘密でも何でもないのだが
)で直接合体(笑)させることに…。ところが…
。
今日、派遣さんが送ってくれたDNAシーケンスの結果をアセンブルしていたのだが、どうにもこうにも矛盾している
。既に分かっているORF全長にアライメントをかけると、得られたシーケンスはきれいに並んでくれるのだが、ある一部だけどうにも並んでくれない。仕方がないので、手動でアライメントを直していくと、どうにも奇妙な結果に…
。どう奇妙かというと、内部プライマーで読んだシーケンスとベクタープライマーで読んだシーケンスの合計三本が、上流と下流からうまく合流するのだが、合流地点で約20 bp程重複してお互いにそこから全く違う配列になっているのだ。分かりにくいが、上流から読んだシーケンスは、合流地点の重複を過ぎるとその先が全く異なる配列に、下流とベクターから読んだリバースのシーケンスも、合流地点の重複を過ぎると上流側とは反対側に向かって全く別の配列が現れるという具合…しかも、この二本のシーケンス結果は見事に一致しているので、シーケンサーによるアーティファクトでもないらしい。微かにイヤな予感がよぎったのだが、なんとか辻褄が合うようにアライメントをずらすものの、如何ともし難く、仕方なく、当の派遣さんの元へ。
聞いてみても、使った鋳型は全部同じもので、そんな矛盾が生じるわけもない。で、ふと耳を疑う言葉が…。「blastxかけると、酵素遺伝子ともう一つヘンなのが引っ掛かるんですよね」…なぁにぃ?(# クールポコ風
)で、もう一度その結果をその場で見てみると…。見覚えのある忌まわしいあの名前が…
。「これです、これ。IS10 トランスポザーゼ?」出たよ…また出たよ…また飛びおった、ISの野郎…
。よりにもよって、ORFの後半中程、端のプライマーでは届きにくい辺りに飛んでくれました。考えてみれば、約20 bp程の重複は、ISのターゲット配列のダイレクト・リピートだったのね
。そのあとのインバーテッド・リピートに気付かないとは、おいらの目もずいぶんと曇っちまったもんだ
。やっちまったなぁ(# 再びクールポコ風
)。
というわけで、作り直しです。発現系構築用にPCR産物をクローン化したプラスミドに既に飛んでいるのかもしれず、元のプラスミドからシーケンスすると同時に、菌体からダイレクトPCRでも増やして、一気にIn-Fusion!って感じです。
# それにしても、ここぞというときに出てきやがるなぁ、ISの野郎…

現在、構築中の酵素遺伝子発現系。単純にlacプロモーター直下に繋いだものは、どうも漏れが激しくてE. coliがどうにも嫌がるらしくて、一切構築物が得られず…



今日、派遣さんが送ってくれたDNAシーケンスの結果をアセンブルしていたのだが、どうにもこうにも矛盾している


聞いてみても、使った鋳型は全部同じもので、そんな矛盾が生じるわけもない。で、ふと耳を疑う言葉が…。「blastxかけると、酵素遺伝子ともう一つヘンなのが引っ掛かるんですよね」…なぁにぃ?(# クールポコ風






というわけで、作り直しです。発現系構築用にPCR産物をクローン化したプラスミドに既に飛んでいるのかもしれず、元のプラスミドからシーケンスすると同時に、菌体からダイレクトPCRでも増やして、一気にIn-Fusion!って感じです。
# それにしても、ここぞというときに出てきやがるなぁ、ISの野郎…
