Degradative Effect of Nattokinase on Spike Protein of SARS-CoV-2
１．はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス感染症2019（COVID-19）が世界的に流行している。
COVID-19パンデミックは4億3,700万人以上に感染し、630万人以上の死者を出した（https://covid19.who.int/、2022年7月4日アクセス）。
SARS-CoV-2の宿主細胞への侵入は、ウイルスエンベロープから伸長するホモ三量体を形成する膜貫通型スパイクタンパク（Sタンパク）によって媒介される。
Sタンパクは、膜貫通セリンプロテイン2（TMPRSS2）、カテプシン、フリンなどのプロテアーゼによって処理され、活性化される。
Sタンパクは、S1とS2の2つの機能的サブユニットから構成され、
SARS-CoV-2のS1サブユニットは、宿主細胞の受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）と相互作用することにより、ウイルス受容体との結合を開始する。
S2サブユニットは、標的細胞とのウイルス融合に関与し、ウイルス侵入を可能にする。
S1サブユニットの受容体結合ドメイン（RBD）は、ACE2との結合を担っている。
Sタンパクの切断は、S1サブユニットとS2サブユニットの境界で起こる。
現在、多くの国でSARS-CoV-2感染を予防するワクチンの開発が進められており、SARS-CoV-2感染の数は減少している。
しかし、ワクチン標的エピトープが変異した株を含め、SARS-CoV-2には多数の変異株が報告されている。
ワクチン接種後にCOVID-19を発症する患者が増加していることから、ワクチン接種ではSARS-CoV-2感染を完全に予防できない可能性がある。
したがって、SARS-CoV-2感染に対する新しい治療法を開発することが重要である。
納豆は大豆を納豆菌で発酵させた人気のある日本の伝統食品である。
ナットウキナーゼは納豆に含まれ、枯草菌が産生する最も重要な細胞外酵素のひとつである。
ナットウキナーゼは275個のアミノ酸からなり、約28 kDaである。
ナットウキナーゼはプラスミノーゲン活性化因子インヒビター-1を不活性化し、線溶を増加させる。
また、フィブリノゲン、第VII因子、サイトカイン、第VIII因子の血漿中濃度を低下させる。
ナットウキナーゼは、天然に知られている抗凝固剤の中で最も高い血栓溶解力を持つ。
臨床試験では、ナットウキナーゼの経口摂取はいかなる副作用も伴わないことが実証された。
このように、ナットウキナーゼは現在、効率的で安全かつ経済的な酵素と考えられており、血栓溶解薬の研究において中心的な注目を集めている。
さらに、ナットウキナーゼはいくつかの腫瘍の治療にも使用されている。
最近の研究で、納豆エキスプロテアーゼが牛ヘルペスウイルス1（BHV-1）およびSARS-CoV-2感染を阻害することが明らかになった。
これらの結果は、納豆エキスプロテアーゼがSARS-CoV-2感染に対して有効である可能性を示している。
本研究では、納豆エキスプロテアーゼによるSARS-CoV-2感染阻害が納豆菌由来のナットウキナーゼによるものかどうかを調べることを目的とした。
２．結果と考察
2.1 In VitroにおけるSARS-CoV-2のスパイクタンパクに対するナットウキナーゼの分解効果
まず、納豆エキス中のナットウキナーゼがSARS-CoV-2のSタンパクを分解できるかどうかを調べた。
SARS-CoV-2のSタンパクは感染時に宿主細胞のACE2レセプターで重要な役割を果たす。
Sタンパク発現細胞溶解液を4倍希釈系列のナットウキナーゼ（32μg/mL，8μg/mL，2μg/mL，500ng/mL，125ng/mL，31.25ng/mL，7.8125ng/mL）と混合した後、
ウェスタンブロッティングを行った。
ナットウキナーゼ濃度500ng/mL，125ng/mL，31.25ng/mL，7.8125ng/mLでSタンパク発現細胞溶解液をD-PBSとインキュベートしたところ、
Sタンパク全長（S1およびS2サブユニット）とS2サブユニットがバンドとして出現した（図1A）。
次に、ナットウキナーゼが時間依存的にSタンパク質を分解するかどうかを調べた。
溶解液を1μg/mLのナットウキナーゼと10-180分間インキュベートした。
SARS-CoV-2のSタンパク質は60-180分のインキュベーションでナットウキナーゼにより分解されたが、
10分および30分のインキュベーションでは分解されなかった（図1B）。
このように、ナットウキナーゼは用量および時間依存的にSタンパクを分解した。
図 1 (A) 用量依存的なナットウキナーゼの分解効果
段階希釈したナットウキナーゼ (32μg/mL，8μg/mL，2μg/mL，500ng/mL，125ng/mL，31.25ng/mL，および 7.8125ng/mL)
を S タンパク発現細胞と混合し、ライセートを加えてインキュベートした。
S タンパクの全長 (S1 サブユニットおよび S2 サブユニット) と S2 サブユニットがそれぞれ上部と下部のバンドとして検出された。
トータルSに対する割合をSタンパクの相対量(S1タンパク+S2タンパク)として示した。
(B) の分解作用
ナットウキナーゼは時間依存的に変化する。
S タンパク発現細胞溶解物を 1μg/mL ナットウキナーゼとともに 0，10，30，60，120，および 180 分間インキュベートした。
(C) 加熱処理またはプロテアーゼ阻害剤の影響
レーン 1： HEK293 ライセート
レーン 2： HEK293 ライセート (S タンパク)
レーン 3：HEK293 (Sタンパク) + ナットウキナーゼ (5μg/mL
レーン 4：HEK293 (Sタンパク) + ナットウキナーゼ (5μg/mL) + プロテアーゼ阻害剤 I
レーン 5： HEK293(Sタンパク) + ナットウキナーゼ (5μg/mL) + プロテアーゼインヒビター III
レーン 6： HEK293(Sタンパク) + 熱処理ナットウキナーゼ (5μg/mL)
(D) S タンパクと ACE2 の RBD に対する分解効果
SタンパクのRBDおよびACE2コードプラスミドをそれぞれHEK293細胞でトランスフェクトした。
細胞溶解物をナットウキナーゼ (7.5μg/mL) および熱処理ナットウキナーゼ (7.5μg/mL) とインキュベートし、ウェスタンブロッティングを行った。
ナットウキナーゼの分解作用が酵素活性によるものであるかどうかを確認するために、ナットウキナーゼを加熱またはプロテアーゼ阻害剤カクテルで処理した。
ナットウキナーゼを100℃で5分間加熱すると、ナットウキナーゼの分解効果は消失した（図1C、レーン6）。
さらに、プロテアーゼ阻害剤を加えると、ナットウキナーゼによるSタンパクバンドの消失はブロックされた（図1C、レーン4と5）。
タンパク阻害剤カクテルIと比較して、AEBSF HCl（4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩）、
不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤であるアプロチニン、システインプロテアーゼであるロイペプチンからなるタンパクカクテルIIIは、
ナットウキナーゼ活性を明らかに阻害した。
ナットウキナーゼは、セリンプロテアーゼのサブチリシンファミリーのメンバーであるSer-His-Asp（Asp32，His64，Ser221）という同じ保存アミノ酸を持っている。
ナットウキナーゼの結晶構造は、枯草菌DB104由来のサブチリシンEの結晶構造とほぼ同じである。
この結果は、ナットウキナーゼがセリンプロテアーゼであるという以前の報告と一致する。
また、RBDとACE2を発現する細胞溶解液を用いてナットウキナーゼの分解作用を評価した。
7.5g/mLのナットウキナーゼと細胞溶解液をインキュベートしたところ、RBDとACE2のバンドは消失した（図1D）。
2.2 細胞表面上のSARS-CoV-2のスパイクタンパク質に対するナットウキナーゼの分解効果
次に、ナットウキナーゼがトランスフェクト細胞表面のSタンパクを分解するかどうかを調べた。
SタンパクはHEK293細胞にトランスフェクトされた。
トランスフェクトされた細胞はナットウキナーゼとともに9時間インキュベートされた。
細胞表面のSタンパクは、細胞を透過させずに抗Sタンパク抗体を用いて検出した（図2A）。
Sタンパクはトランスフェクト細胞で検出された。
トランスフェクト細胞をナットウキナーゼで処理すると、細胞表面のSタンパクは減少した。
細胞を25μg/mLおよび2.5μg/mLのナットウキナーゼで処理すると、Sタンパク陽性面積と核陽性面積の比は減少してそれぞれ約0.3および0.7になった（図2B）。
ナットウキナーゼの分解効果は、細胞毒性がない場合に観察された（図2C）。
ウェスタンブロッティング分析によると、トータルSタンパクはナットウキナーゼ処理とコントロール処理で変化しなかった（補足図；図S1）。
これらの結果は、ナットウキナーゼが非毒性濃度範囲でSARS-CoV-2のSタンパク質を分解することを示している。
図2 （A）細胞表面のSタンパクに対するナットウキナーゼの分解効果
Spike-pcDNA3.1をHEK293細胞にトランスフェクトし、9時間インキュベートした後、
培養液にナットウキナーゼ（25μg/mLおよび2.5μg/mL）を添加し、さらに13時間インキュベートした。
細胞表面のSタンパクは抗スパイクタンパク抗体（赤）で、核はDAPI（青）で染色した。
(B）核陽性領域に対するSタンパク質領域の比率
各サンプルにつき3枚の画像を撮影し、Sタンパク／核陽性面積を算出した。データは平均値＋SDで示し、
p値はRソフトウェア（R-3.3.3 for windows）を用いた一元配置分散分析（ANOVA）とTukeyのポストホックテストにより求めた（** p < 0.01; *** p < 0.001）。
(C）細胞生存率はMTTアッセイで評価した
ナットウキナーゼを培養液に添加し、13時間インキュベートした後、MTTアッセイを行った。
本研究では、ナットウキナーゼのプロテアーゼ活性がSタンパクの分解に寄与していることを明らかにした。
ナットウキナーゼは宿主細胞のSタンパク質だけでなくACE2も分解する。
ナットウキナーゼを細胞溶解液に混ぜてin-vitroで評価したところ、ハウスキーピングタンパクであるGAPDHも同時に分解されたことから、
ナットウキナーゼのプロテアーゼ特異性は低いと考えられる（補足図；図S2）。
一方、細胞に添加した場合、細胞生存率には影響を示さず、細胞表面での保護剤として働くことが期待される。
ナットウキナーゼのタンパク分解効果を理解するためには、質量分析による分解産物のさらなる解析が必要である。
ナットウキナーゼは、SARS-CoV-2 Sタンパクに対する強力な分解活性を有し、
抗動脈硬化作用、脂質低下作用、降圧作用、抗血栓作用、線溶作用を有することが示されている。
高血圧や心血管系の合併症を持つ患者は、COVID-19によって容易に重症化する可能性がある。
SARS-CoV-2には、ワクチン標的エピトープが変異した株を含む多数の変異型が出現しているため、
ワクチン接種だけではSARS-CoV-2感染を完全に防御できないかもしれない。
ナットウキナーゼと納豆抽出物は、COVID-19の予防と治療のための新世代の薬剤として開発される可能性を秘めている。
3．材料と方法
3.1 材料
ナットウキナーゼはContek Life Science Co. Ltd.（台湾、台北市）から入手した。
ナットウキナーゼ活性は60,000 FU/g（FU、線溶単位）であった。
プロテアーゼ阻害剤ⅠⅢは富士フイルム和光純薬株式会社（大阪）から購入した。
発現プラスミド（pcDNA3.1-SARS2-Spike C9 with tag at the C-terminal, pcDNA3.1-hACE2, およびpcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP）は、
Addgene(Watertown, MA, USA)から購入した。
HEK293(JCRB9068)細胞はJCRB細胞バンク(大阪、日本)から入手した。
3.2 細胞培養とウェスタンブロッティング
HEK293細胞は、3.5×10^5 cells/mLの密度で培養した。
10%FBS、L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM中で一晩培養した。
各プラスミド（pcDNA3.1-SARS2-Spike、pcDNA3-SARSCoV-2-S-RBD-sfGFP、
またはpcDNA3.1-hACE2）で細胞をトランスフェクトし、22時間培養した。
培養後、培養細胞を掻き取り、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で洗浄した。
細胞計数を行い、xTractorバッファー（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を細胞沈殿に添加した。
細胞溶解液を1300×gおよび4℃で10分間遠心し、上清を新しいチューブに移して使用するまで－80℃で保存した。
タンパク濃度は、BCAアッセイキット（タカラ製）を用いて、ビシンコニン酸（BCA）タンパクアッセイにより測定した。
10μLのナットウキナーゼと10μLの細胞溶解液（1μμg/mL）を37℃で1時間インキュベートした。
プロテアーゼ阻害剤を使用する場合は、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIとIIIをD-PBSで10倍に希釈し、
10μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル溶液をナットウキナーゼと細胞溶解液の混合物に加えた。
等量の反応混合物をロードし、ウエスタンブロッティングを行った。
一次抗体には、抗ロドプシン（C9）マウスモノクローナル抗体（1D4）（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）、
抗GAPDHマウスモノクローナル抗体（富士フイルム和光）、抗GFPタグマウスモノクローナル抗体（Proteintech, Rosemont,IL, USA）、
抗ACE2抗体（Proteintech）を用いた。
二次抗体には、HRP標識ヤギ抗マウス抗体（Proteintech）が含まれる。
3.3 免疫蛍光アッセイ
HEK293細胞を、10% FBS、L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEMの中で、
8ウェルチャンバーを用いて3.5×10^5 cells/mLの密度で培養した。
細胞をpcDNA3.1-SARS2-Spikeでトランスフェクトし、9時間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞をサンプル処理し、13時間培養し、4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。
SARS-CoV/SARS-CoV-2とのインキュベーション後 スパイクモノクローナル抗体（1A9）（GeneTex, CA, USA）と1時間インキュベートした後、
Cy3標識ヤギ抗マウス抗体と1時間インキュベートした。
スライドをDAPI Fluoromount-Gで染色し、蛍光顕微鏡（BZ-X710, Keyence, Osaka, Japan）で観察した。
Sタンパク陽性領域および核陽性領域は、BZ-X710付属の解析ソフト（BZ-X710）を用いて算出した。
付属の解析ソフトウェア（BZ-X Analyzer）を用いて算出した。
細胞生存率は、3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assayを用いて評価した。
細胞を24ウェル培養プレートで培養した。
細胞を500g/mLのMTTを含む500LのDMEMに懸濁した。
37℃で3時間インキュベートした後、4mM HClを含む500Lのイソプロパノールを加え、MTTホルマザンを溶解した。
吸光度はマイクロプレートリーダーを用いて570 nmで測定した。
4. 結論
本研究において、セリンプロテアーゼであるナットウキナーゼがSARS-CoV-2のSタンパクを分解することを明らかにした。
納豆エキスに含まれるナットウキナーゼがSARS-CoV-2感染を抑制できるかどうかを検討するため、
Sタンパク発現細胞溶解液とナットウキナーゼを用量および時間依存的に混合し、Sタンパクの分解を解析した。
SタンパクのRBDはACE2の膜遠位部分に結合する。
納豆エキスはRBD分解を介してVero E6細胞におけるSARS-CoV-2感染を阻害することが報告されている。
我々は、ナットウキナーゼによるSタンパクの分解が、熱またはタンパク阻害剤処理によって阻害されることを示した。
このデータは、ナットウキナーゼのプロテアーゼ活性がSタンパクの分解に重要な役割を果たしていることを示唆している。
これらの知見を総合すると、納豆エキスによるSARS-CoV-2感染の阻害は、
ナットウキナーゼによるSタンパクの分解に起因するという考え方が支持される。
このように、我々のデータは、
ナットウキナーゼと納豆エキスがSタンパクの分解を介してSARS-CoV-2の宿主細胞侵入を阻害する潜在的な効果を持つことを示している。
