ミスリードな2人が決めた5-11才接種勧奨あり
昨日、鹿Dr.を手放しで称賛し鈴木基参考人を中傷する記事を書きましたが、私の勇み足でしたので訂正し再UPしました。
私は超過死亡の定義を誤って理解していました。これは、鹿Dr.も同じだと思います。
感染研によると、超過死亡とは、予測死亡数の95%片側予測区間（上限）を超える観測死亡数、のようです。
したがって、鈴木参考人が提出資料のなかで使っている超過死亡は公式の定義どおりであり、おかしな点はなにもありません。
日本の超過および過少死亡数ダッシュボード
すべての死因を含んでいるので、その中からワクチン副反応死を分離するのは困難です。
でも、分離できないからといって副反応死が少ないとは言えず、ワクチンが安全であるとも言えません。
鈴木参考人は分離できないことを接種推進に利用しているように思えます。
molbio08さん
世界ワクチン接種キャンペーンが始まってから１年が経ち、いろんなことがわかってきました。
１年前には逆転写は起きないと思われていましたが、起きることを実証した査読済み論文も出てきました。
様々な不都合な真実がこれからどんどん現れてくるはずです。
ワクチンを打つ人は大規模治験に参加している自覚を持つべきです。
2回目を打った人は３回目を打ってはいけません。
5－11歳の子どもたちには絶対に打たせてはいけません。
Pfizer BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 のヒト肝細胞における細胞内逆転写について
受付：2022年1月18日 / 改訂：2022年2月19日 / 受理：2022年2月23日 / 発行：2022年2月25日
概要
Pfizer社とBioNTech社が開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2の前臨床試験において、
BNT162b2注射を受けた動物に可逆的な肝機能の効果が確認された。
さらに、最近の研究では、SARS-CoV-2 RNAが逆転写され、ヒト細胞のゲノムに統合されることが示された。
本研究では、BNT162b2がヒト肝細胞株Huh7に及ぼす影響をin vitroで検討した。
Huh7細胞をBNT162b2に暴露し、細胞から抽出したRNAに対して定量PCRを行った。
その結果、Huh7細胞においてBNT162b2が高レベルで検出され、
内因性逆転写酵素であるlong interspersed nuclear element-1（LINE-1）の遺伝子発現が変化することが確認された。
BNT162b2 で処理した Huh7 細胞で LINE-1 open reading frame-1 RNA-binding protein (ORFp1) に結合する抗体を用いた免疫組織染色により、
LINE-1 の核内分布が増加することが示唆された。
BNT162b2で処理したHuh7細胞のゲノムDNAをPCRしたところ、BNT162b2に特異的なDNA配列が増幅された。
この結果は、BNT162b2がヒト肝細胞Huh7に速やかに取り込まれ、LINE-1の発現と分布に変化をもたらすことを示している。
また、BNT162b2のmRNAは、BNT162b2曝露後、6時間という短時間で細胞内でDNAに逆転写されることも示した。
1. はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019（COVID-19）は、
2020年3月11日に世界保健機関（WHO）によってグローバルパンデミックと発表され、破壊的な健康危機として浮上した。
2022年2月現在、COVID-19は世界中で4億3,000万人以上の感染症例と590万人の死者が報告されている。
COVID-19に関連する罹患率および死亡率を低減するために、有効かつ安全なワクチンが緊急に必要とされている。
COVID-19用のいくつかのワクチンが開発されており、特にmRNAワクチン（ファイザー・ビオテック社およびモデルナ社）、
複製欠損組換えアデノウイルスベクターワクチン（ヤンセン・ジョンソン・アンド・ジョンソン社、アストラゼネカ社、スプートニックV社、カンシノ社）、
不活化ワクチン（シノファーム社、バラットバイオテック社、シノバック社）に焦点が当てられている。
mRNAワクチンは、免疫原の設計や製造が柔軟かつ効率的に行えるという利点があり、現在、数多くのワクチン候補が様々な開発・応用段階にある。
具体的には、Pfizer社とBioNTech社が開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2が臨床試験で評価され、
世界各地のCOVID-19国家予防接種キャンペーンで投与され、成功に至っている。
BNT162b2は、脂質ナノ粒子（LNP）カプセル化したヌクレオシド修飾RNAワクチン（modRNA）で、
抗原的に最適な融合前コンフォメーションを確保するために2つのプロリン変異で修飾したSARS-CoV-2スパイク（S）タンパク質の完全長をコードし、
ウイルス中和抗体を誘導するために無傷のウイルスを模倣している。
無作為化臨床試験と一致し、BNT162b2は実環境におけるCOVID-19関連の幅広い転帰において高い有効性を示した。
とはいえ、ワクチンの長期的な安全性と有効性のモニタリングなど、多くの課題が残っている。
このため、さらなる評価と調査が必要である。BNT162b2の安全性プロファイルは、現在、短期間の臨床試験からしか得られていない。
BNT162b2のあまり一般的でない副作用として、心膜炎、不整脈、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、頭蓋内出血、血小板減少症などが報告されている。
また、他の種類のワクチンで観察された副作用を報告する研究もある。
ワクチンに関連する副作用のメカニズムをよりよく理解するためには、臨床研究だけでなく、細胞や分子レベルでの解析が必要だ。
最近の研究では、SARS-CoV-2 RNAが逆転写され、ヒト細胞のゲノムに組み込まれることが示された。
このことは、SARS-CoV-2 RNAの一部をコードしているBNT162b2でもこのようなことが起こりうるのではないかという疑問を生じさせる。
ファイザー社が欧州医薬品庁（EMA）に提供した薬物動態データでは、BNT162b2の生体内分布が、
放射性標識したLNPとルシフェラーゼmodRNAをマウスとラットに筋肉内注射することで調べられた。
最初の時間点（0.25 時間）からほとんどの組織で放射能が検出され、その結果、注射部位と肝臓が主な分布部位であり、投与後 8-48 時間で最大濃度が観察された。
さらに、BNT162b2 の注射を受けた動物では、肝臓の肥大、空胞化、γGT（γglutamyl transferase）値の上昇、
AST（aspartate transaminase）値および ALP（Alkaline phosphatase）値の上昇などの可逆的肝障害が観察された。
LNP送達システムによって引き起こされる一過性の肝障害は以前に報告されている。
それにもかかわらず、modRNAを含まない空のLNPだけでは、有意な肝障害が生じないことも示されている。
そこで、本研究では、BNT162b2のヒト肝細胞株への影響をin vitroで調べ、BNT162b2が内因性メカニズムによりDNAに逆転写されるかどうかを調べることを目的とする。
2. 材料と方法
2.1 細胞培養
Huh7細胞（JCRB Cell Bank, Osaka, Japan）は、10％（v/v）牛胎児血清（Sigma-Aldrich, F7524-500ML, Burlington, MA, USA）
および1％（v/v）ペニシリン-ストレプトマイシン（HyClone, SV30010, Logan, UT, USA）で補充したDMEM培地（HyClone, HYCLSH30243.01） で37℃、5％CO2で培養させた。
BNT162b2処理には、Huh7細胞を24ウェルプレートに200,000cells/wellの密度で播種した。
BNT162b2 mRNAワクチン（Pfizer BioNTech, New York, NY, USA）は、製造者のガイドラインに記載されているように、
滅菌0.9%塩化ナトリウム注射液、USPで最終濃度100 μg/mLに希釈した。
次に、BNT162b2懸濁液を、最終濃度が0.5、1.0、または2.0μg/mLとなるように細胞培養液中に添加した。
Huh7細胞を、BNT162b2と共に、またはBNT162b2なしで、6、24、および48時間インキュベートした。
細胞をPBSで十分に洗浄し、トリプシン化によって採取し、さらなる使用まで-80℃で保存した。
2.2 リアルタイムRT-QPCR
細胞からRNAをRNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, 74134, Hilden, Germany)を用いて製造者のプロトコルにしたがって抽出した。
RT-PCR は RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA) を用いてメーカーのプロトコルにしたがって行った。
リアルタイムqPCRは、BNT162b2、LINE-1、ハウスキーピング遺伝子ACTBおよびGAPDHのプライマーを用いて、
Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) を用いて行った（表1）。
2.3 免疫蛍光染色と共焦点画像化
Huh7細胞を8室スライド（LAB-TEK, 154534, Santa Cruz, CA, USA）で40,000 cells/wellの密度で、
BNT162b2 (0.5, 1 or 2 µg/mL) とともに、またはなしで、6時間培養した。
免疫組織化学は、一次抗体抗LINE-1 ORF1p マウスモノクローナル抗体（Merck, 3574308, Kenilworth, NJ, USA）、
二次抗体 Cy3 Donkey anti-mouse (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) およびHoechst (Life technologies, 34850, Carlsbad, CA, USA) を用いて、
サーモフィッシャー（Waltham, MA, USA）からのプロトコルに従い実施された。
Zeiss LSM 800と63X油浸対物レンズを用いて1条件につき2枚の画像を撮影し、
ImageJ 1.53cにより1画像あたり15細胞の個々の全細胞領域と核領域について染色強度を定量化した。
細胞質に対するLINE-1染色強度は、細胞全体の染色強度から核の染色強度を差し引くことで算出した。
偏りを防ぐため、細胞のすべての画像に乱数を割り当てた。
核（Hoechst染色により決定）と細胞全体（LINE-1蛍光の境界により決定）をマークするために、フリーハンド選択ツールを使用した。
その後、これらの領域を測定し、平均強度を用いて、各グループを比較した。
2.4 ゲノムDNA精製、PCR増幅、アガロースゲル精製、サンガーシークエンス
ゲノムDNAは、先に述べたプロトコルに従って、
PBNDバッファ（10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.45% NP-40, 0.45% Tween-20）を用いて細胞ペレットから抽出した 。
DNA調製物から残留RNAを除去するために、RNase (100 µg/mL, Qiagen, Hilden, Germany) をDNA調製物に加え、
37℃で3時間、その後95℃で5分インキュベートした。
その後、BNT162b2を標的とするプライマー（配列は表1に示す）を用いて、以下のプログラムでPCRを行った。
95℃で5分、95℃30秒、58℃30秒、72℃1分を35サイクル、最後に72℃5分、12℃5分、PCR産物は1.4% (w/v) アガロースゲルで測定した。
予想されるサイズ（444 bps）のアンプリコンに対応するバンドを切り出し、QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen, 28104, Hilden, Germany）を用いて、
製造者の説明書に従って、DNAを抽出した。
DNAアンプリコンの配列は、Sanger sequencing (Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany)によって確認した。
統計情報
統計的比較は、両側スチューデントのt検定およびANOVAを用いて行った。
データは、平均値±SEMまたは±SDで表した。p < 0.05の差は有意であるとみなされる。
2.5 倫理的記載事項
Huh7 細胞株は、Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) Cell Bank から入手した。
3. 結果
3.1 BNT162b2はヒト肝細胞株Huh7細胞に高い効率で侵入する
BNT162b2 がヒト肝細胞に入るかどうかを調べるために、ヒト肝細胞株 Huh7 を BNT162b2 に曝露した。
Huh7細胞におけるLNP送達の取り込み動態に関する以前の研究では、LNPの最大生物学的効果は4-7時間の間に観察された。
そこで、本研究では、Huh7細胞を濃度の増加したBNT162b2（0.5，1.0および2.0 µg/mL）とともに、あるいはまったく加えずに6，24および48時間培養し、
細胞からRNAを取り出して、図1に示すようにBNT162b2配列を標的とするプライマーを用いてリアルタイム定量逆転写PCR（RT-qPCR）を実行した。
BNT162b2の全配列は公開されており、2ヌクレオチドのキャップ；ヒトα-グロビン遺伝子の5′-UTRを組み込んだ5′-非翻訳領域（UTR）を含んでいる。
SARS-CoV-2のSタンパク質全長と2つのプロリン変異
；ヒトミトコンドリア12S rRNA（mtRNR1）セグメントとヒトAES/TLE5遺伝子セグメントと2つのC→U変異
；ポリ（A）テールを含む3′-UTRを含んでいる。
BNT162b2のSタンパク質配列を詳細に解析した結果、
ヒトゲノム配列と100％一致する配列が124個、19〜26ntsに1塩基（nt）のみミスマッチのある配列が3個見つかった（表S1、補足資料参照）。
BNT162b2のRNA量を検出するために、フォワードプライマーがSARS-CoV-2のSタンパク質領域に、リバースプライマーが3′-UTRに位置するプライマーを設計し、
ヒトゲノム領域と非特異結合せずにBNT162b2固有のPCRアンプリコンを検出することができるようにした。
Figure 1. BNT162b2 の mRNA レベル検出と逆転写に使用した PCR プライマーセット。
BNT162b2 のイラストは既出の文献[34]から引用した。
RT-qPCRの結果、BNT162b2で処理したHuh7細胞は、6、24、および48時間で、
ハウスキーピング遺伝子と比較して高レベルのBNT162b2 mRNAを有した（図2、非常に高いレベルのため、log(2-ΔΔCT)で示される）。
BNT162b2 mRNAレベルは、6時間と比較して24時間で有意に減少したが、48時間では再び増加した。
注：log(2-ΔΔCT)は、log(2^CT)=CT*log2≒0.301*CTの意味であり、CTは、PCR法におけるCT値を示す。
Figure 2. BNT162b2 で処理した Huh7 細胞における BNT162b2 mRNA レベル。
Huh7 細胞を BNT162b2 なし（Ctrl）、または 0.5 µg/mL （V1）、1 µg/mL （V2）、および 2 µg/mL （V3）で 6 時間（緑点）、
24 時間（オレンジ点）、48 時間 （青点）処理した。RNAを精製し、BNT162b2を標的としたプライマーを用いてqPCRを実施した。
BNT162b2のRNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびACTBに対するlog(2-ΔΔCT)値として示される。
結果は5回の独立した実験から得たものである（n＝5）。それぞれのグループ間の差は、
両側スチューデントのt-検定を用いて分析した。
データは、平均±SEMとして表される。
(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. 各時点におけるそれぞれのコントロール、または示された通り)。
3.2 ヒト内在性逆転写酵素 Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1) に対する BNT162b2 の影響
ここでは、LINE-1遺伝子の発現に対するBNT162b2の影響を検討した。
BNT162b2 (0, 0.5, 1.0, 2.0 µg/mL) で6, 24, 48時間処理したHuh7細胞から精製したRNAについて、
LINE-1を標的とするプライマーを用いてRT-qPCRを実施した。
2.0 µg/mL BNT162b2 によって 6 時間後にコントロールと比較して有意に増加した LINE-1 の発現が観察されたが、
より低い BNT162b2 濃度ではすべての時間点で LINE-1 の発現が減少した（図 3）。
Figure 3. BNT162b2 で処理した Huh7 細胞における LINE-1 mRNA レベル。Huh7細胞を、BNT162b2なしで（Ctrl）、
または0.5（V1）、1（V2）、および2μg/mL（V3）で、6時間（緑の点）、24時間（赤い点）、および48時間（青い点）処理した。
RNAを精製し、LINE-1を標的とするプライマーを用いてqPCRを実施した。
LINE-1のRNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子GAPDHおよびACTBに対する2-ΔΔCT値として示される。
結果は、5つの独立した実験からのものである（n＝5）。それぞれのグループ間の差は、両側スチューデントのt-検定を用いて分析した。
データは、平均±SEMとして表される。
（* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001 vs. 各時点でのそれぞれのコントロール、または示された通り；† p < 0.05 vs. 6 h-Ctrl）。
次に、LINE-1タンパク質レベルに対するBNT162b2の影響を検討した。
全長LINE-1は、5′非翻訳領域（UTR）、2つのオープンリーディングフレーム（ORF）、ORF1およびORF2、3′UTRからなり、
そのうちORF1はシャペロン活性を有するRNA結合タンパク質であった。
LINE-1のレトロトランスポジション活性は、ORF1の核内移行が関与していることが示されている。
BNT162b2 (0.5, 1.0 and 2.0 µg/mL) で6時間処理したまたは処理していないHuh7細胞を固定し、
細胞核を可視化するためにLINE-1 ORF1p に結合する抗体、およびDNA特異的プローブHoechstで染色した（図4a）。
免疫蛍光染色強度の定量化は、BNT162b2が、試験したすべての濃度において、また
全細胞領域および核の両方においてLINE-1 ORF1pタンパク質レベルを増加させることを示した（図4b-d）。
Figure 4. BNT162b2 で処理した Huh7 細胞の LINE-1 タンパク質分布に関する免疫組織化学的研究。
細胞を固定し、LINE-1 ORF1pに結合する抗体（赤）および細胞核を可視化するためのDNA特異的プローブHoechst（青）で染色した。
(a）BNT162b2で処理した、またはBNT162b2なしで処理したHuh7細胞におけるLINE-1発現の代表的な画像である。
(b-d）全細胞領域（b）、細胞質（c）、および核（d）におけるLINE-1タンパク質の定量化。
すべてのデータは、One-Way ANOVAを用いて分析し、グラフは、GraphPad Prism V 9.2を用いて作成した。
すべてのデータは平均値±SDで示した（** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001 as indicated）。
3.3 Huh7細胞における逆転写されたBNT162b2 DNAの検出
以前の研究で、LINE-1タンパク質の核内への侵入はレトロトランスポジションと関連していることが示された。
上記の免疫蛍光染色実験では、核内のLINE-1レベルの増加は、BNT162b2の最低濃度（0.5 µg/mL）で既に観察された。
LINE-1が上昇したときにBNT162b2がDNAに逆転写されるかどうかを調べるために、
0.5 µg/mLのBNT162b2で6, 24,48時間処理したHuh7細胞からゲノムDNAを精製し、RNaseで処理してRNAを除去し、
図1に示すようにBNT162b2標的プライマーでPCR処理を施した。
増幅されたDNA断片は、電気泳動によって可視化され、ゲル精製された（図5）。
BNT162b2のDNAアンプリコンは、3つのタイムポイント（6、24、48時間）すべてで検出された。
サンガーシークエンスにより、このDNAアンプリコンはプライマーに挟まれたBNT162b2の配列と同一であることが確認された（表2）。
また、DNAアンプリコンがBNT162b2 RNAではなくDNAに由来することを確認するために、
0.5 μg/mL BNT162b2で6時間処理したHuh7細胞から精製したRNAに対して、
RNase処理ありまたはなしでPCRを行った（図5のCtrl 5および6）ところ、
PCRにかけたRNA試料からはアンプリコンが検出されなかった。
Figure 5. BNT162b2 で処理した Huh7 細胞における BNT162b2 の DNA アンプリコンの検出。
Huh7 細胞を BNT162b2 なし（Ctrl）または 0.5 µg/mL で 6,24,48 時間処理し、ゲノム DNA を精製して 100 µg/mL の RNase で消化した。
図1および表1に示すように、BNT162b2を標的とするプライマーを用いて、すべてのサンプルについてPCRを行った。
DNAアンプリコン(444 bps)はアガロースゲル上で可視化された。
BNT: BNT162b2; L: DNA ladder; Ctrl1: 培養Huh7細胞; Ctrl2: 培養Huh7細胞。6時間後に回収したBNT162b2処理なしのHuh7細胞
；Ctrl3: 24時間に収集したBNT162b2処理なしのHuh7細胞；Ctrl4：48時間に収集したBNT162b2処理なしのHuh7細胞
；Ctrl5：BNT162b2を0.5μg/mLで6時間処理したHuh7細胞からのRNA
；Ctrl6：BNT162b2を0.5μg/mLで6時間処理し、RNaseで消化されたHuh7細胞からのRNA
4. 考察
本研究では、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2がin vitroでヒト肝細胞株Huh7に侵入することができるという証拠を提示した。
BNT162b2 mRNAは、BNT162b2曝露後6時間という速さで、細胞内でDNAに逆転写される。
逆転写のメカニズムとして、内因性逆転写酵素LINE-1を介する可能性があり、LINE-1の核内タンパク質分布はBNT162b2によって上昇した。
肝細胞におけるLNPの細胞内蓄積はin vivoで証明されている。
BNT162b2に関する前臨床研究では、BNT162b2がヒト細胞株HEK293T細胞に入り、BNT162b2抗原の強固な発現につながることが示された。
そこで、本研究では、まず、ヒト肝細胞株Huh7細胞におけるBNT162b2の侵入を検討した。
この研究で使用したBNT162b2濃度の選択には説明が必要である。
BNT162b2は3週間間隔で2回投与され、各投与量は0.3 mLに30 µgのBNT162b2を含むので、注射部位の局所濃度は最高で100 µg/mLとなる。
同様のLNP送達システムを用いたH10N8およびH7N9インフルエンザウイルスに対するmRNAワクチンに関する以前の研究では、
mRNAワクチンは、肝臓、脾臓、心臓、腎臓、肺および脳などのいくつかの器官にむしろ非特異的に分布し、
肝臓での濃度は、筋肉内注射部位での濃度よりもおよそ100倍低くなることが示されている。
ファイザーがEMAに提出したBNT162b2の評価報告書では、
ラットの薬物動態分布試験で、総投与量の比較的大きな割合（最大18％）が肝臓に分布することが実証された。
そのため、肝細胞を用いた実験では、0.5，1，2μg/mLのワクチンを使用することにした。
しかし、より広い範囲の低濃度および高濃度のBNT162b2の効果も、今後の研究で検証する必要がある。
今回、我々はヒト肝細胞株を用いて、in vitroでの調査を行った。
肝細胞にもワクチン由来のスパイクタンパク質が存在し、
あらかじめプライミングされたスパイクタンパク質反応性細胞傷害性T細胞のターゲットとなる可能性があるため、検討に値する。
BNT162b2ワクチン接種後に自己免疫性肝炎を発症した人の症例報告[39]がある。
BNT162b2の肝機能への潜在的影響についてより良く理解するために、今後の研究ではin vivoモデルが望まれる。
BNT162b2 の毒性報告では、遺伝毒性試験および発がん性試験は行われていない。
我々の研究では、肝細胞株Huh7においてBNT162b2がDNAに逆転写されることが示されており、
BNT162b2由来のDNAが宿主ゲノムに統合されてゲノムDNAの完全性に影響を与え遺伝毒性副作用を介する可能性があるのではないか、
という懸念が生じる可能性がある。
現段階では、BNT162b2から逆転写されたDNAが細胞ゲノムに統合されるかどうかは分かっていない。
BNT162b2がゲノムの完全性に及ぼす影響を実証するには、BNT162b2に曝露した細胞の全ゲノム配列決定、
およびBNT162b2ワクチン接種を受けたヒト被験者の組織など、さらなる研究が必要である。
ヒト自律型レトロトランスポゾンLINE-1は、細胞の内因性逆転写酵素であり、ヒトに唯一残る活性トランスポゾンで、
それ自身と他の非自律型要素をレトロトランスポーズすることができ、ヒトゲノムの〜17%はLINE-1配列で構成されている。非自律的なAlu要素，
short, interspersed nucleotide element (SINEs), variable-number-of-tandem-repeats (VNTR) や細胞内のmRNA処理された偽遺伝子は、
トランスで働くLINE-1逆翻訳タンパク質によって逆翻訳される。
最近の研究では、内在性のLINE-1がSARS-CoV-2配列の逆転写と感染ヒト細胞のゲノムへの組み込みを仲介していることが示された。
さらに、内因性LINE-1の発現は、SARS-CoV-2感染を含むウイルス感染時にしばしば増加する。
これまでの研究から、LINE-1レトロトランスポジション活性は、RNA代謝、DNA損傷応答 、
オートファジーによって制御されていることが分かっている。
LINE-1の効率的なレトロトランスポジションは、しばしば細胞周期や有糸分裂中の核膜破壊 、
外来レトロウイルスと関連しており、LINE-1の核内への侵入を促進する。
我々の研究では、試験したすべての濃度（0.5，1，2μg/mL）で、BNT162b2によって核内の免疫組織化学で決定されるLINE-1 ORF1p分布が増加し、
LINE-1遺伝子発現の上昇がBNT162b2最高濃度（2μg/mL）で検出された。
遺伝子の転写はクロマチン修飾、転写因子制御、RNA分解速度によって制御されるが、
タンパク質の翻訳制御には開始コドン上でのリボソーム動員、ペプチド伸長の調節、
タンパク質合成の終了、またはリボソーム生合成が含まれることは注目に値する。
この2つのプロセスは異なるメカニズムで制御されているため、外的なチャレンジに応答して必ずしも同じ変化パターンを示すとは限らない。
BNT162b2に対するLINE-1活性の正確な制御については、さらなる研究が必要である。
本研究で用いた細胞モデルは癌細胞であり、非分裂性の体細胞とは異なり、DNA複製が活発である。
また、Huh7細胞は、RNA代謝に関与するタンパク質の発現が増加するなど、
大きく異なる遺伝子およびタンパク質発現を示すことが示されている。
しかし、骨髄や上皮基底層などのヒト組織や胚発生期においても細胞増殖は活発であり、
そのような条件下でのBNT162b2のゲノムインテグリティへの影響を検討する必要がある。
さらに、LINE-1の効果的なレトロトランスポジションは、ヒト神経細胞のような非分裂細胞や終末分化細胞においても報告されている。
ファイザー社のEMA評価報告書は、BNT162b2が脾臓（1.1％未満）、副腎（0.1％未満）に分布し、
さらに卵巣および精巣（0.1％未満）において低く測定できる放射能があることも示している。
さらに、BNT162b2の胎盤移行に関するデータは、ファイザー社のEMA評価報告書からは得られない。
その結果、BNT162b2のmRNAは、注射部位濃度の0.5％に相当する濃度（0.5μg/mL）でHuh7細胞に容易に入り、
LINE-1遺伝子およびタンパク質の発現変化を誘発し、6時間以内にBNT162b2の逆転写が検出されることが分かった。
したがって、in vitroおよびin vivoの両方で、他の細胞タイプや組織に対するBNT162b2の効果をさらに調査することが重要である。
5. 結論
本研究は、COVID-19 mRNAワクチンBNT162b2のヒト肝細胞株への影響に関する初のin vitro研究である。
我々は、BNT162b2の細胞への速い進入と、その後のBNT162b2 mRNAのDNAへの細胞内逆転写に関する証拠を提示した。
www.DeepL.com/Translator（無料版）で翻訳しました。
この論文は最新かつ査読付きです。
厚生労働省はつぎのように言っています。
新型コロナワクチンＱ＆Ａ
厚生労働省のQ＆Aはこびナビが監修しています。
こびナビの見解（2021/02/21）
削除される前にスクショをとっておきましょう。
憲法を変えろだとか、9条を廃止しろだとか、核兵器を持てだとか、頭の弱いのがウヨウヨ湧いてきてワーワー言っています。
日本は戦争できない国だということがわからないのですかね。
そもそもロシアや中国と同等の軍事力は持てないし、仮に持てたとしても国土が狭いのはどうしようもない弱点です。
核兵器を一発打ち込まれたら終りですから。それと、日本は石油から食料まで何から何まで外国に頼らざるを得ないない国です。
長期の戦いになると兵糧攻めされて一億総餓死ですよ。日本の生き残る道は平和主義のみです。それしかありません。
国は外からの力で壊れると思っている人が多いようですがそれは違います。内部から崩れるのです。それがいま起きています。
12歳以上の国民の8割は遺伝子ワクチンに汚染されています。これから何が起きるかわかりません。最悪のばあい民族滅亡です。
だから5－11歳児に打ってはいけません。民族の種を残すべきです。
ドクター・ナガセが解説／地獄のようなファイザー内部資料／ワクチンはガンへの引き金
11：54～
A－正常な細胞には細胞膜があります。その役目は異物をいれないことです。
すべての細胞には異物を入れないための発達したメカニズムがあります。
その「異物」のひとつがmRNAとDNAのセグメントです。
この注射液を作るのに必要なのは細胞を騙してmRNAを入れることです。
脂肪微粒子というものを使いました。mRNAを脂肪でくるんだのです。
油のコーティングは細胞と融合し細胞内にmRNAを放出します。
しかし若い細胞には問題があります。未知の機能があるからです。
それは逆転写酵素と呼ばれ胚などの若い細胞に存在します。
若い細胞といえば子どもたちですね。子どもは大人と違って成長します。
成長中の細胞では逆転写酵素の活性化が著しいのです。
成長中の細胞はレトロトランスポゾンというセグメントを書き換えますが、
これは未解明の遺伝子セグメントなのです。
レトロトランスポゾンは逆転写酵素でmRNAでもなんでも転写します。
そして転写したものをなんでもコピー＆ペーストしてDNAに取り込んでしまいます。
それはDNAを恒久的に変えてしまい、細胞は二度と元には戻りません。
Q－わかりました。Dr.ナガセ、いくつか質問があります。
子どものほうが逆転写酵素が活発なので、副作用の発生率が高いのですか？
A－そうです。そのとおりです。
細胞は永遠のスパイクプロテイン工場に生まれ変わったんです。
Q－大事な質問です。子どもは大人の30㎍に対して10㎍の接種だから安全と聞くけど、
これが細胞内で自己増殖するわけです。投与量の違いに意味はありますか？
A－ありません。十分な量があれば1/3も1/10も変わりません。
ただ自己増殖する時間が変わるだけです。安全な量はありません。
Q－あなたは体内の遺伝子変化だと言いましたが、それは永続的ですか？一生続きますか？
A－そうです。永続的です。
Q－私は疫学者とウイルス学者に話をききましたが元に戻る方法はないそうです。
AーDNAに何かが入り込んだ場合、それを取り除くには細胞の死しかありません。
Q－ワオ…、ため息の時間をください。
お話はすべてうかがいました。Dr.ナガセ、細胞内に入り込むために脂質で覆うとか…
これはもう生物兵器というしかないですね。
A－生物兵器として認定できます。細胞を永続的に変えるようにデザインされています。
細胞を騙して非人間的なプロテインを作り、それは細胞の健康に何の役にも立ちません。
スパイクプロテインは毒物です。DNAの修復を阻害し、突然変異の起因となります。
Q－いまこの時点で約300人のアスリートが競技場で倒れて約7割が死亡しています。
心筋炎を発症する10代もいます。心膜炎、心筋炎、脳梗塞、麻痺、ギランバレー症候群。
何が起こるでしょうか？これを5歳児に注射したら…。
Aー子どもが犠牲になるとしか言えません…。
Q－では、5歳から11歳の子どもが死んでいくんですね…。
A－かつて見たこともないほどの副作用が出るでしょう。
ワクチンの歴史上見られなかった副作用がすでに出ています。
これは許し難いです。絶対に許せないことです。
日本を5－11歳児へのワクチン接種の実験場にしてはいけません。
追記 2022.02.26
鹿Dr.は和久田が好き 
英国国家統計局のデータによると、１回接種、２回接種とも、接種していない子どもに比べ、死亡者数が著しく増加していることが明らかになった。
英国国家統計局（ONS）は、COVID-19のワクチンを接種した子どもたちの死亡率が、接種しなかった子どもたちの52倍であることを示すデータを発表した。
ONSは12月、英国の5歳ごとの死亡率を、COVID-19ワクチン接種の有無でグループ分けし、年齢標準化したデータを発表した。
データは、2021年1月1日から10月31日までの期間を占めている。
ONSは「COVID-19を含む死亡の年齢グループおよびワクチン接種状況別の月齢標準化死亡率、10万人年当たり」を集計したが、
18歳以上のデータのみを提示したものである。
しかし、12歳の子どもにも接種が可能で、その子どもたちは親の意向に反して接種を受けることができる。
また、限られたケースだが、5歳の子どもには、量を減らして投与している。
The Exposéが指摘するように、「接種状況別の死亡者数および人年」をまとめた別の表には、10歳以上の5歳階級データが含まれている。
このデータから、10万人年当たりの死亡率を計算することができる。
ワクチン未接種者、1回接種者、2回接種者など、ある「接種」グループに属する者は、すぐに次のグループに移るため、
一定期間の死亡率をよりよく表すには、より単純な人口10万人当たりの計算よりもこの区分を優先して使用することになる。
ONSの報告書の表9は、10ヶ月間全体の「ワクチン接種状況別、5歳階級別の死亡数および人年数」を示している。
それによると、10-14歳の未接種者は2,094,711人年、15-19歳は1,587,072人年であることがわかる。
英国では、10代の若者への接種開始後、子どもの死亡が44％増加したことがデータで示された。
上の表から10万人年を計算すると、若年層（10-14歳）は10万人年あたり20.9人、高齢層（15-19歳）は15.9人が未接種であることがわかる。
続いて、各グループの死亡者数を10万人年で割って、10万人年当たりの死亡率を算出する。
その結果、10-14歳のグループでは、10万人年当たりの未接種死亡率は4.6であり、15-19歳のグループでは10万人年当たりの未接種死亡率は10.1であることがわかった。
同じデータセットと計算で、接種を1回受けた10-14歳の死亡率は10万人年あたり45.1人、接種を1回受けた15-19歳の死亡率は10万人年あたり18.3人であった。
英国では、これらの年齢層で、COVIDワクチンを2回接種した場合には死亡率はさらに高く、
15-19歳では10万人年あたり32.9人、10-14歳では10万人年あたり238.4人と驚異的な死亡率になっている。
このデータでは、1回接種、2回接種とも、接種していない子どもと比較して、死亡者数が著しく増加していることが示されている。
15-19歳の子どもでは、1回目では約2倍、2回目では3倍以上に死亡リスクが高まる。
一方、10-14歳の子どもたちは、1回目の接種でほぼ10倍、2回目の接種で、接種しない場合に比べて51.8倍も死亡リスクが高まる。
平均すると、昨年1月から10月までの間に、COVIDワクチンを1回以上接種した10歳から19歳の子どもは、死亡する確率が3.7倍高くなったことになる。
さらに、ONSが発表した10～14歳の子どもの2015～2019年の「性・年齢別週平均死亡数」の数値によると、
記録された死亡数は、ONSが2021年に発表した週平均の数値よりも44％上昇している。
ワクチン接種プログラムに関する英国政府の独立アドバイザーであるJCVIは、9月3日の声明で、
”利用可能な証拠は、12歳から15歳の者におけるCOVIDワクチン接種による個々の健康上の利益は小さいことを示す “と判断した。
彼らは、ワクチン接種によって得られる利益は、”潜在的な既知の害よりもわずかに大きい “だけであり、
”潜在的な害の大きさについてはかなりの不確実性がある “と認めている。
COVIDワクチン接種に伴うリスクの不確実性を考慮すると、JCVIは、
”現時点では、それ以外の健康な12歳から15歳の子どもへの普遍的なワクチン接種プログラムに関する助言を支持するには、利益が小さすぎる “と考えている。
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瀬戸大橋開通30年⑥瀬戸大橋に新幹線は通るのか
新幹線などとんでもない。瀬戸大橋線は廃線にすべきです。瀬戸大橋は危ないんです。
何が怖いかというと疲労が怖いんです。
斜張橋が危ない。櫃石島橋と岩黒島橋です。
あんなに重い列車が毎日何度も往復するのだから疲労するのに決まってるじゃないですか。
海に落ちますよ。その日はいつかわからないけれど間違いなく落ちる。
そのとき誰が責任をとるんですか。三木さんですか？
追記 2022.02.24
瀬戸大橋線開業前電気機関車走行試験
Vaccine Effectiveness Continues to Fall ? Triple Vaccinated Now Up to Three Times More Likely to be Infected, UKHSA Data Show
ワクチン効果の低下が続く - 3回目ワクチン接種者が感染する確率は最大3倍に、UKHSAのデータより
先週の大きなニュースは、スコットランド当局が、もう十分だと判断し、ワクチンの接種状況による感染、入院、死亡のデータの公表を停止するというものだった。
これは驚くべきことではない。
公衆衛生上の介入が失敗したことを人々に知らせないようにする最善の方法は、それが失敗したことを知らせる情報を与えるのを止めることである。
これらのデータがなければ、スコットランド当局は、ワクチンは素晴らしいものであり、国民を救ったのだと言い続けることができる。
一方、データは、たとえ短期的にプラスの影響を与えたとしても、せいぜい「複雑な絵」を描くだけであることを示唆している。
少なくともイングランドでは、今のところまだワクチンの性能についてかなり良いデータが発表されているのだが...。
そして、今週の更新だ。Freedom PodcastのTwitterで、最新のUKHSAのデータをうまくまとめているのを見た。
Covidの予防接種がCovidの流行を解決していないのは明らかで、むしろ悪化（死亡）させているかもしれない状況なのだ。
入院の72％、死亡の87％がワクチン接種者であるのに、ワクチン未接種のパンデミックというのは確かにおかしい。
もちろん、悪魔は細部に宿るもので、この具体的なケースでは、
異なる年齢層の間の変動（高齢者はワクチン接種を受ける可能性が高いが、死亡する可能性も高い）である。
今週のデータでは、すべての年齢層、ワクチン接種の有無にかかわらず、感染は引き続き減少しており、12月と1月のオミクロンの波が急速に引いているようだ。
ほぼすべての年齢層で、ワクチンの接種回数が多いほどCovidに感染するリスクが高いことが、引き続きデータから示されている。
18歳以下と80歳以上の2つの年齢層は、他の年齢層と異なっている。
18歳以下では、ワクチン未接種者の感染率が高いのは、少なくとも部分的には、より最近のワクチン接種（全回数）を反映していると思われる。
80歳以上（70-80歳でもある程度）については、何が起こっているのか明らかではない。
12歳以下と65歳以上の免疫系は、成人の大部分とは異なっており、
これらの集団では異なった疾病パターンや特徴が見られると予想されることを常に念頭に置いておく必要がある。
感染率のデータから、感染に対するワクチンの効果を再推定することができる。
18歳未満を除くすべての年齢層で効果はマイナスで、ブースター接種を受けている人は特にマイナスだ。
今週は、全年齢層におけるワクチン効果の時間変化（今年）をグラフにするのに十分なデータが得られたので、
50歳未満と50歳以上のグラフに分けてご紹介する。 まず、50歳未満の経年変化を示す。
1回接種の場合は比較的低いが安定した感染リスクの上昇、2回接種の場合は安定しているが高い感染リスク、
ブースター接種の場合は依然として感染リスクの上昇が見られ、40歳代は未接種者に比べて最大3倍の感染リスクがあることがわかった。
このデータから明らかにわかる点は、18歳未満ではワクチンによる感染拡大の影響が少ないことだ。
これは、彼らの強固な自然免疫システムを反映しており、単に最近のワクチン接種がリスク上昇を出現させる時間がなかったためでないことを願う。
50歳以上の感染データでは、別の絵が描かれている。
唯一はっきりしているのは、どの年齢層でも、何回接種しても、未接種の人に比べてCovidのリスクが高くなるということだ。
なぜワクチンが感染リスクの上昇をもたらすのかはまだ明らかではない。
これを説明するメカニズムはいくつかあるが、ワクチン接種プログラムの長期的な成果を決定するものであるから、
本当はもっと多くの研究がなされるべきなのだ。
感染に関するデータで複雑なのは、検査レベルの低下（無料検査の廃止を含む）と再感染による影響が懸念されることだ。
再感染は集計に含まれるようになったが、前回の検査から90日経過した場合のみ再感染と分類される。
検査の状況は、過去1ヶ月の公式発表の症例数と、Zoe Symptom Trackerに症状を報告した人々の差によって説明される。
－下に両者のグラフを掲載した（ 上左：公式データ、上右：Zoeデータ、下：最新のONS感染調査）－
公式の症例数はクリスマスのオミクロンピーク以降減少しているが、Zoe Symptom Trackerは2回目のピークを示していることに注目してほしい。
ONS感染調査では、この2つの中間的なパターンを示している。
この複雑さが解析に与える影響は不明である。
なお、検査用綿棒のサンプルのゲノム解析から、Zoeデータの第2のピークは単にBA.2変異体ではないことが示唆されている。
－イングランドではまだ多くは感染していないようだ。
変異株については、我々の分析では、オミクロンの登場がワクチン効果の低下を引き起こしていると考えられる程度、を超えている。
－ もし、単にオミクロンがより多くのワクチン逃避を達成したことによる影響であれば、
過去2、3回のデータポイントでワクチン効果は横ばいになっているはずだ。
データからはそれ以上のことが起こっていることが示唆されている。
しかし、それは継続的かつ急速な抗体の減少なのか、それとも別の何かなのだろうか？
UKHSAが発表した変異株に関するデータについて考えてみよう。
最新の報告書の対象期間は、グラフの右側の赤い四角で強調されている。
ワクチン防御率の継続的な低下は、変異株オミクロンBA.1.1（および/またはおそらくBA.2）が変異株オミクロンBA.1と比較して、
さらなるワクチン逃避を達成し、これらの変異株が短期的に急速な再感染を引き起こす可能性さえあることを示している。
ここでも、公式データとZoeデータの間の不一致を説明するために、より多くの情報が必要である。
入院に対するワクチンの予防効果については、データはかなり一貫している。
3回接種ではすべての年齢層で入院に対するある程度の予防効果があり、2回接種では効果はほぼゼロであるように見えるが、
1回しか接種していない人は入院のリスクが高くなるようである。
感染のデータとは異なり、入院のデータは、Covidの "with vs of "の問題で複雑ではあるが、かなり堅牢であることに注意されたい。
死亡予防のデータも入院のデータと同様で、ブースター接種を受けた人にはかなりの予防効果が残っており、
2回の接種ではごくわずかな予防効果、1回の接種では負の予防効果（すなわち死亡リスクを高める）があるようだ。
40歳未満の死亡率は非常に低いため、ノイズの多い結果となり、80歳以上のデータは、グループ内の脆弱性の幅が非常に大きいため、
複雑なものとなっている。
この最後のグラフでは、ワクチンを1回または2回しか接種していない人の死亡リスクが高くなっているが、
オミクロンの登場によってCovidの死亡率が大幅に低下していることに注目することが重要だ。
多くの人の生活に影響を与えている広範な「Covidへの恐怖」は、2020年初頭のウイルスのリスクに関する情報に基づいており、
このレベルの恐怖は2022年初頭には適切ではない。
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厚労省か゛あせって3回目を打たせたい理由
基礎疾患のない若者の死亡はこれで２例目です。共通しているのは２回接種済みです。
武漢株からデルタ株まで若者は感染しても死ななかったのです。
亡くなるケースも稀にあるけれど、基礎疾患や肥満など健康に不安をかかえた若者に限られていました。
ホントに、いままでこんなことはなかったんです。
共通項「２回接種済み」の影響を考えざるを得ないのではないでしょうか。
追記
ニュースになっていませんが、愛知県岡崎市でも10代の若者が亡くなっています。
とにかく、若者であれ老人であれ未接種者であれ2回接種者であれ、発症したら直ちに病院に直行すべきです。
たいていの医者は逃げ回っているけれど、診てくれる医者はネットで探せばどこかにあります。
追記 2022.02.21
鹿Dr.とほぼ同じことを苫米地さんが１年前に言ってます。
Dr.苫米地英人がコロナワクチンを解説
8：24～
常駐的な何の悪さもしない自分の細胞であって自分の中のメッセンジャーRNAを呼んで作られたリボソームでであえたスパイクタンパクがついた細胞は、
身体の中に残る可能性が十分ある。それがホメオスタシスで免疫寛容される可能性がある。そうするとキラーＴ細胞に除去されずに全身に残る可能性があるんですよ。
普通はメッセンジャーRNAの方は3～4日で細胞内で分解されるので大丈夫ですけど、合成されたスパイクタンパクが体内に残ると、これは細胞レベルで生体が変化するんですよ。
新人類に私たちは進化するわけですよ。SARSウイルス入り細胞を全身に持った人工細胞人間に私たちは進化することができる。
問題となっているのはその後ですよ。もしも変異種だったり別のコロナウイルスね、普通の風邪だってコロナウイルス、に感染した場合、
今度は全身に、ヤバイ私の身体にこんなのあったわ、と言って全身の正常なスパイク発現細胞を一斉に攻撃するリスクがある。
2012年の論文で、動物のSARSのメッセンジャーRNAを使った動物実験ですけど、けっこうヤバイことが起きてて死んでるんですよね。
そういうことで、アメリカでは特に高年齢層がリスクとされていて、アメリカではずーっと、メッセンジャーRNAワクチンは承認されないんですよ。
15：42～
追記 2022.02.21
内山順造医師はADEではないかと言っています。
追記 2022.02.22
東京で10代女性死亡。
・新規感染者数
Our World in Data
世界平均よりも多い。
・新規死亡者数
Our World in Data
日本は世界平均を超えた。
・ワクチン接種率
Our World in Data
こんなに打っているのにぜんぜん効かん 
それなのに国民は打ちたがる 
・ヤク中患者＝国民
・薬物売人＝ワクチン担当大臣（反社会勢力の手下）
概要
背景
青年期の心筋炎は、コロナウイルス疾患用mRNAワクチン2019（COVID-19）の2回目投与後に臨床的に診断される。
目的
ファイザー・ビオンテックワクチン２回目投与直後に発生した青年の死亡例について、剖検顕微鏡による心臓所見を調べ、
これらの例で述べられた“心筋炎”が心筋炎の典型的な病理組織を有するかどうかを判断することである。
計画
2回目のファイザー・ビオンテックワクチン投与直後に死亡した10代の少年2人の臨床および剖検調査。
結果
顕微鏡検査では、典型的な心筋炎の病理組織ではなく、カテコールアミンによる傷害に類似した特徴を示した。
結論
これらのワクチン後の心臓に見られる心筋傷害は、典型的な心筋炎とは異なり、
カテコラミンを介したストレス（毒性）心筋症に最もよく似た外観を呈している。
これらの症例は典型的な心筋炎とは異なり、サイトカインストームはカテコールアミンとのフィードバックループを持つことが知られており、
スクリーニングと治療の指針になると思われる。
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彼らはワクチン接種後の心筋炎を公式に認めており、その病理学的特徴を調べて治療の指針を作ろうとしている。
隠すことしか考えない日本とは大違いだ。
10代の心筋炎患者は日本にはこんなにいる（ファイザーのみ）。
コロナワクチン副反応データベース検索
