肺内細菌叢は自己免疫性脊髄炎の発症に関与する

腸内細菌叢が様々な自己免疫疾患に関与することに関しては多くの研究がなされています。一方肺内細菌叢についてはほとんど研究が進んでいません。この論文で著者らは、ラット自己免疫性脊髄炎モデル（EAEモデル）を用いて、Prevotella melaninogenicaなどの肺内細菌が肺内のeffector T cellを活性化⇒Effector T cellが中枢神経に移動し、microgliaを活性化⇒炎症性サイトカイン産生という経路で脊髄炎を増悪させること、neomycinの肺胞内投与⇒肺内におけるLPS濃度上昇⇒I型インターフェロン反応⇑⇒肺内のeffector T cell 活性化⇓⇒中枢神経におけるmicroglia活性化⇓という経路で脊髄炎を改善させることを報告しました。Neomycinの肺胞内投与は腸内細菌叢を変化させませんでした。キャッチ―な結果であり、免疫学者に新たな研究ネタを提供するということでNatureに掲載されたのだと思いますが、多発性硬化症などのヒト疾患において肺内細菌叢が変化するかどうかは今のところ不明であり、実際に臨床的な意義があるかは今後の検証が必要そうです。 

Hosang L et al., The lung microbiome regulates brain autoimmunity. Nature . 2022 Mar;603(7899):138-144.

正常・病的組織からの線維芽細胞アトラスの作成

近年多くの組織におけるsingle cell RNA sequencing (scRNA-seq)データが蓄積され、組織特異的な、あるいは疾患特異的な細胞clusterが明らかにされています。この論文で著者らは組織線維芽細胞 (fibroblasts, FB)にもいくつかのsubsetsがあり、病的な状態において特異的に活性化されるFB clustersが存在する可能性を報告しています。

著者らはまず非造血細胞のscRNA-seq datasetsを用いて、16正常組織についてのマウスFB特異的なsingle-cell atlasを作成しました。このatlasを用いて、200以上のdifferentially expressed genes (DEGs)を同定し、10個のFB clustersに分類しました (代表的な発現遺伝子から Pi16+, Col15a1+, Ccl19+, Coch+, Comp+, Cxcl12+, Fbln1+, Bmp4+, Npnt+, Hhip+ clustersと命名)。この中でほぼすべての組織に存在したのがPi16+およびCol15a1+ clustersでした。Pi16+およびCol15a1+ clustersには幹細胞関連遺伝子の発現も認められ、これらのclustersから他のclustersが枝分かれする可能性が示唆されました。著者らはPi16+, Col15a1+ clustersに高発現する遺伝子としてdermatopontin (Dpt)を同定しました (Dpt+Pi16+およびDpt+Col15a1+をuniversal FBと命名しています)。

次に著者らはFBが疾患にどのように関与しているかを検討するために、公開されている病的な13組織からの17のscRNA-seq datasetsを用いてPi16+, Col15a1+, Ccl19+, Cxcl12+, Comp+, Npnt+, Hhip+, Adamdec1+, Cxcl5+, Lrrc15+という10のclustersを同定しました。興味深いことに、Cxcl5+, Adamdec1+, Lrrc15+といったclustersは正常状態の組織では見られず、様々な組織の病的状態特異的に活性化されるFB clustersである可能性が示唆されました。Cxcl5+ clusterは筋損傷早期に現れ、PI3K, TNF, NFκBシグナルで制御されてCcl2, Ccl7を産生します。Adamdec1+ clusterは腸炎で増加し、MAPKの制御のもとにIL11やGrem1を産生します。そしてLrrc15+ clusterは関節炎、皮膚創、線維化、膵管腺癌で増加し、myofibroblastに特徴的なCthrc1, Acta2, Postn and Adam12, collagensなどの遺伝子発現が見られ、TGFβの制御を受けると考えられました。Dpt+Pi16+ FBが最も幹細胞関連遺伝子を発現しており、Dpt+Pi16+ FB→Dpt+Col15a1+ FB→疾患特異的なFBという推移を経る可能性が示唆されました。

同様の現象はヒトにおいても見られました。著者らは3例の膵癌患者の癌組織および周囲の正常組織から得られたサンプルのscRNA-seqを用いて、c3, c8という2つのclusterを同定しました。これらはcancer-assocaited FB (CAFs)およびnormal FBとしてアノテーションされ、マウスuniversal FBの遺伝子発現プロフィールとの類似性から、c8 FBはマウスuniversal FBに該当するものであり、ヒトnormal FB clusterと考えられました。またヒトc3シグネチャーは、マウスのLrrc15+ myofibroblast clusterに濃縮されていることがわかりました。興味深いことに関節リウマチ、間質性肺疾患、潰瘍性大腸炎などのFBシグネチャーも、マウスのLrrc15+ myofibroblast clusterにあたる遺伝子発現パターンを示しました。

最後に著者らは様々な病的FBのデータを統合したFBアトラスを作成しました。このアトラスは6つのclustersが同定され、疾患特異的なパターンを有する可能性が示されました。

ということで、fibroblast biologyともいえるサイエンスが急速に進歩している中で、近い将来疾患特異的なFBを標的とした治療戦略も開発されるのではないかと期待されます。

Buechler, M.B., Pradhan, R.N., Krishnamurty, A.T. et al. Cross-tissue organization of the fibroblast lineage. Nature (2021). 

TNFαの破骨細胞前駆細胞に対する作用はepigenetic statusによって変化する

関節リウマチ (RA)におけるTNFα阻害療法の有効性、特に関節破壊抑制効果は臨床的に確立されているため、TNFαが破骨細胞分化を促進することは自明だと考えている人が多いかもしれませんし、そのような先入観に沿った結果を報告している論文は山ほどあります。しかしこれはそれほど自明のことではなく、例えばRANKLおよびM-CSF (CSF-1)による骨髄マクロファージから破骨細胞への分化系にTNFαを添加すると多くの場合は抑制的に作用します。このメカニズムについてはこれまでに多くの研究が行われています。例えばBrendan BoyceらはTNFαがTRAF3の活性化を介して細胞内のNF-kappaB p100蓄積を誘導することが破骨細胞分化を抑制する可能性を報告しています(Yao et al., J Clin Invest. 2009 Oct; 119(10): 3024-34)。とはいえTNFαのパラドキシカルな役割については未だ十分に理解されている訳ではありません (破骨細胞愛のない多くの人にとってはどうでも良いことでしょうし・・)。

このような先行研究を知ってか知らずか、本論文の著者らは破骨細胞前駆細胞の種類によるTNFαの作用の違いを報告しています。彼らはまずTNFαがCD14+単球系前駆細胞 (MO)からのRANKL+M-CSFによる破骨細胞分化に抑制的に働くことを確認しています。CD14+ MOをM-CSF存在下で培養すると、RANKおよびM-CSF受容体（CSF-1R）の発現が上昇します。興味深いことに、やはりRANKL+M-CSFの存在下で破骨細胞へと分化するCD14−CD16−CD11c+ myeloid細胞 (CD11c+ per-OC)は、CD14+ MOと比較してRANK発現が高い一方CSF-1Rの発現は低く、RANK promoter領域のH3K4me3修飾が亢進し、アクティブなepigenetic statusになっていると考えられました。またTNFαはCD14+ MOからの破骨細胞分化を抑制するのに対し、CD11c+ pre-OCから破骨細胞の分化には影響しないことも明らかになりました。TNFαのCD14+ MOからの破骨細胞分化抑制作用はTNFR1-IKKβ-NFκB pathwayを介していること、CD14+ MOからの破骨細胞分化の過程でTNFR2の発現上昇が見られ、TNFR2を介するシグナルは破骨細胞分化を促進することが示されました。

さて実際の臨床例ではRA患者末梢血中ではCD14+ MOの割合に変化はなく、CD11c+ pre-OCは有意に減少していましたが、これは組織中にtrapされているためかもしれません。またRA患者のCD14+ MOではRANK, TNFR1のH3K4me3修飾が亢進している一方、TNFR2, CSF1Rでは亢進は見られないなど、正常とは異なったepigenetic statusを示すことも明らかになりました。またTNFαによる破骨細胞分化抑制効果が見られないpopulation (non-responder)も存在することが示されました。Non-responderではCSF1Rの発現が低く、VEGFRの共受容体として作用するNRP1とCSF1Rとが関連することも示唆されました。

最後はグダグダになってしまった感もありますが、epigeneticな修飾の違いがTNFαの作用の違いを説明する可能性があるという点は興味深いと思います。とはいえH3K4me3だけで話しをされてもねー（´・ω・｀）

Cecilia Ansalone et al., TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Ann Rheum Dis. 2021 Mar 10;annrheumdis-2020-219262. doi: 10.1136/annrheumdis-2020-219262.

TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors

Objectives Circulating myeloid precursors are responsible for post-natal osteoclast (OC) differentiation and skeletal health, although the exact human precursors have not been defined. Enhanced osteoclastogenesis contributes to joint destruction in rheumatoid arthritis (RA) and tumour necrosis factor (TNF) is a well-known pro-osteoclastogenic factor. Herein, we investigated the interplay between receptor activator of nuclear factor kappa-Β ligand (RANK-L), indispensable for fusion of myeloid precursors and the normal development of OCs, and TNF in directing the differentiation of diverse pre-OC populations derived from human peripheral blood. Methods Flow cytometric cell sorting and analysis was used to assess the potential of myeloid populations to differentiate into OCs. Transcriptomic, epigenetic analysis, receptor expression and inhibitor experiments were used to unravel RANK-L and TNF signalling hierarchy. Results TNF can act as a critical homoeostatic regulator of CD14+ monocyte (MO) differentiation into OCs by inhibiting osteoclastogenesis to favour macrophage development. In contrast, a distinct previously unidentified CD14−CD16−CD11c+ myeloid pre-OC population was exempt from this negative regulation. In healthy CD14+ MOs, TNF drove epigenetic modification of the RANK promoter via a TNFR1-IKKβ-dependent pathway and halted osteoclastogenesis. In a subset of patients with RA, CD14+ MOs exhibited an altered epigenetic state that resulted in dysregulated TNF-mediated OC homoeostasis. Conclusions These findings fundamentally re-define the relationship between RANK-L and TNF. Moreover, they have identified a novel pool of human circulating non-MO OC precursors that unlike MOs are epigenetically preconditioned to ignore TNF-mediated signalling. In RA, this epigenetic preconditioning occurs in the MO compartment providing a pathological consequence of failure of this pathway.

TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors

表皮プロテインC受容体が抗リン脂質抗体症候群の病態に関与する

抗カルジオリピン抗体 (aCL)や抗β2GPI抗体などの抗リン脂質抗体 (aPLs)の出現を特徴とする抗リン脂質抗体症候群 (APS)患者は、臨床的に動･静脈の血栓症、血小板減少症、習慣流産･死産･子宮内胎児死亡などを呈する難病で、原発性APSとともに、全身性エリテマトーデス (SLE)などの自己免疫疾患にしばしば合併することが知られています。APSにおける凝固亢進のメカニズムには不明な点が多く、aPLsがどのような抗原を認識するのかについての理解も進んでいないことが、APS治療法開発が進まない原因となっています。この論文で著者らは、endothelial protein C receptor (EPCR)がaPLsの標的となり、APSの病態に重要な役割を果たすことを明らかにしました。

EPCRは内皮細胞、骨髄細胞、胎盤のtrophoblastなどに発現が見られるCD1d様膜貫通糖タンパクであり、リン脂質と強固に結合します。正常状態ではホスファチジルコリンと結合したEPCRは抗凝固因子であるprotein Cを活性化しますが、EPCRは凝固開始因子tissue factor (TF)によるprotease-activated receptor 2 (PAR2)活性化にも関与し、TLR4の下流でtype I interferon (IFN) responseを誘導することも知られており、抗凝固のみならず凝固亢進、自己免疫反応にも関与する可能性が示されています。

主としてlate endsomeに発現するlysophosphatidic acid (LBPA)はEPCRと反応して複合体 (EPCR-LBPA)を形成することが知られていますが、著者らはaPLsがEPCR-LBPAを認識し、EPCR依存的にendosomeに輸送され、TLR7/8活性化を介してtype I IFN resposnseを誘導して組織炎症、凝固亢進、胎児死亡を誘導すること、そしてB1a細胞活性化によってaPLsの産生を促進することを明らかにしました。抗体によってEPCR-LBPA抑制、あるいは遺伝的にEPCRを欠損させることによりAPSモデルマウスの凝固亢進は抑制されました。またSLEモデルマウスにおけるaPLs産生もEPCR-LBPA抗体によって抑制されました。

これらの結果は、aPLsによるEPCR-LBPAの活性化がAPSのみならずSLEの病態に重要な役割を果たす可能性を示しています。新型コロナウイルス感染症においてもaPLsの出現と凝固亢進が報告されており、この病態におけるEPCR-LBPAの関与にも興味がもたれます。

Nadine Müller-Calleja et al., 

Lipid presentation by the protein C receptor links coagulation with autoimmunity.

Science  12 Mar 2021: Vol. 371, Issue 6534, eabc0956 DOI: 10.1126/science.abc0956

Lipid presentation by the protein C receptor links coagulation with autoimmunity

Several autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus and primary antiphospholipid syndrome, are characterized by the presence of antiphospholipid antibodies (aPLs). These molecules can activate the complement and coagulation cascades, which contributes to pathologies such as thrombosis, stroke, and pregnancy complications. Müller-Calleja et al. found that endothelial protein C receptor (EPCR) in complex with lysobisphosphatidic acid (LBPA) is the cell-surface target for aPL and mediates its internalization (see the Perspective by Kaplan). aPL binding to EPCR-LBPA resulted in the activation of tissue factor–mediated coagulation and interferon-α production by dendritic cells. Interferon-α, in turn, fueled the expansion of B1a cells, which secrete aPLs. The specific blockade of this target in mice inhibited the development of aPL autoimmunity, offering hope for future therapies for these conditions. Science , this issue p. [eaay1833][1]; see also p. [1100][2] ### INTRODUCTION Antiphospholipid antibodies (aPLs) transiently appear in infectious diseases but can persist in primary antiphospholipid syndrome (APS) or in association with other autoimmune diseases, including lupus erythematosus. Clinical manifestations of APS range from venous thrombosis and stroke to severe microangiopathic organ damage and pregnancy complications. The activation of coagulation and complement cascades is crucial for the pathogenic effects of aPLs as well as for their proinflammatory cell signaling in innate immune, vascular endothelial, and embryonic trophoblast cells. However, the diverse reactivity of aPLs with negatively charged lipids and with blood proteins has hampered the identification of the central mechanism(s) underlying aPL pathogenic signaling. ### RATIONALE Lipid-reactive aPLs sensitize innate immune cells to toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and up-regulate the coagulation initiator tissue factor (TF). TF-dependent signaling by protease-activated receptor 2 (PAR2) involves the endothelial protein C receptor (EPCR, encoded by PROCR ), and this signaling complex specifically participates in interferon (IFN) responses downstream of TLR4. Because aPLs are potent inducers of IFN-α production by dendritic cells, we tested the hypothesis that EPCR contributes to APS pathologies and the development of aPL autoimmunity. ### RESULTS We found that EPCR serves as the cell surface receptor for aPLs and mediates aPL internalization following a previously delineated TF–integrin trafficking route in monocytes. Knock-in mutagenesis of the EPCR intracellular cysteine residue in Procr C/S mice abolishes aPL endosomal trafficking and aPL proinflammatory and IFN signaling in innate immune cells. We show that these mutant mice have a defect in the ability to exchange phosphatidylcholine structurally bound to EPCR with a late endosomal lipid, lysobisphosphatidic acid (LBPA). This exchange requires ALG-2-interacting protein X (ALIX)–dependent endolysosomal sorting. aPL binding specifically to cell surface EPCR-LBPA disrupts an inhibited TF complex and thereby induces coagulation activation that elicits autocrine PAR signaling in monocytes. This initial aPL effect translocates acid sphingomyelinase (ASM) to the cell surface, where it is activated by EPCR-LBPA to alter the procoagulant membrane properties of monocytes. Stereoselective LBPA loading of EPCR is also required for aPL signaling in embryonic trophoblast cells. Procr C/S mice or mice treated with a specific function-blocking antibody to EPCR-LBPA are protected from aPL-induced thrombosis and fetal loss. Notably, EPCR-LBPA engagement not only promotes the detrimental pathological consequences of aPLs but also drives dendritic cell IFN-α production for expansion of aPL-producing B1a cells. In an experimental model of APS, Tlr7−/− and Procr C/S mice cannot expand B1a cells responsible for production of lipid-reactive aPLs. Blockade of EPCR-LBPA signaling is sufficient to prevent the development of aPLs in mice with a TLR7-dependent systemic lupus erythematosus–like syndrome. Moreover, lupus-associated kidney pathology is markedly attenuated by the inhibition of EPCR-LBPA signaling. ### CONCLUSION Pathogenic aPLs recognize a single cell-surface lipid–protein receptor complex that is positioned at the intersections of coagulation and innate immune signaling and involved in the regulation of antimicrobial host defense. Specific blockade of this target not only prevents the pathological consequences of aPLs in vivo but also impairs a self-amplifying autoimmune signaling loop contributing to the development of APS autoimmunity. ![Figure][3] The recognition of EPCR-LBPA by aPLs promotes autoimmunity. The interaction of aPLs with EPCR-LBPA promotes activation of embryonic trophoblast cells, monocytes, and dendritic cells. (Right) On monocytes, disruption of the inhibitory control of the coagulation initiator TF induces cellular activation through PAR signaling, which is responsible for recruiting ASM to the cell surface. EPCR-LBPA activation of ASM then causes procoagulant lipid exposure and aPL endosomal trafficking. The subsequent up-regulation of tumor necrosis factor (TNF) and TF is central to thrombosis and pregnancy complications. (Left) In addition, aPL induction of IFN-α in dendritic cells sustains a TLR7-dependent expansion of aPL-producing B1a cells and thereby promotes autoimmunity. NOX, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase; ROS, reactive oxygen species. Antiphospholipid antibodies (aPLs) cause severe autoimmune disease characterized by vascular pathologies and pregnancy complications. Here, we identify endosomal lysobisphosphatidic acid (LBPA) presented by the CD1d-like endothelial protein C receptor (EPCR) as a pathogenic cell surface antigen recognized by aPLs for induction of thrombosis and endosomal inflammatory signaling. The engagement of aPLs with EPCR-LBPA expressed on innate immune cells sustains interferon- and toll-like receptor 7–dependent B1a cell expansion and autoantibody production. Specific pharmacological interruption of EPCR-LBPA signaling attenuates major aPL-elicited pathologies and the development of autoimmunity in a mouse model of systemic lupus erythematosus. Thus, aPLs recognize a single cell surface lipid–protein receptor complex to perpetuate a self-amplifying autoimmune signaling loop dependent on the cooperation with the innate immune complement and coagulation pathways. [1]: /lookup/doi/10.1126/science.aay1833 [2]: /lookup/doi/10.1126/science.abg6449 [3]: pending:yes

Lipid presentation by the protein C receptor links coagulation with autoimmunity

TNF-αは静脈内皮細胞におけるClaudin-11低下を介して静脈からのChloride漏出を誘導する

この論文で著者らはTNF-αが静脈特異的にChlorideイオンの漏出を促進し、その過程にはTNF-αによる静脈内皮細胞の細胞間tight junctionタンパクClaudin-11の低下が関与していることを明らかにしました。TNF-αの下流ではPanx1 channel活性化→TRPV4 Ca++ channelの活性化が生じ、これがATPの細胞外への放出を誘導します。放出されたATPはendonucleotidease CD39によってadenosineへと加水分解を受け、A2A adenosine受容体の活性化を誘導し、結果として静脈内皮細胞におけるClaudin-11の低下と漏出増加をきたします。著者らはこれが敗血症におけるTNF-αの病態形成メカニズムの一つではないかとしています。

関節リウマチの病態においてもTNF-αによる静脈からのChloride漏出が関与しているのでしょうか？ところでMTXは細胞外adenosineを増加させ、A2A 受容体を活性化することが抗炎症作用に働く可能性が報告されています。A2A 受容体活性化という点ではMTXとTNF-αと共通しているようにも思えるのですが、両者の作用がどのような関係にあるのかは興味深いところです。

Maier-Begandt D et al., A venous-specific purinergic signaling cascade initiated by Pannexin 1 regulates TNFα-induced increases in endothelial permeability. Sci Signal. 2021 Mar 2; 14(672): eaba2940.

A venous-specific purinergic signaling cascade initiated by Pannexin 1 regulates TNFα-induced increases in endothelial permeability

A challenge in treating sepsis, a potentially life-threatening, systemic inflammatory disorder, is the increase in endothelial permeability that leads to widespread tissue edema and immune cell infiltration. Maier-Begandt et al. uncovered a signaling pathway activated specifically in veins by TNFα, a proinflammatory cytokine whose circulating concentrations increase greatly during sepsis. TNFα treatment resulted in the activation of Panx1 channels, which stimulated a signaling pathway that led to disrupted tight junctions in veins but not in arteries. Sepsis induced less lung edema and was less fatal to Panx1-deficient mice compared to control mice. Thus, targeting this pathway may improve survival in patients experiencing sepsis. The endothelial cell barrier regulates the passage of fluid between the bloodstream and underlying tissues, and barrier function impairment exacerbates the severity of inflammatory insults. To understand how inflammation alters vessel permeability, we studied the effects of the proinflammatory cytokine TNFα on transendothelial permeability and electrophysiology in ex vivo murine veins and arteries. We found that TNFα specifically decreased the barrier function of venous endothelium without affecting that of arterial endothelium. On the basis of RNA expression profiling and protein analysis, we found that claudin-11 (CLDN11) was the predominant claudin in venous endothelial cells and that there was little, if any, CLDN11 in arterial endothelial cells. Consistent with a difference in claudin composition, TNFα increased the permselectivity of Cl− over Na+ in venous but not arterial endothelium. The vein-specific effects of TNFα also required the activation of Pannexin 1 (Panx1) channels and the CD39-mediated hydrolysis of ATP to adenosine, which subsequently stimulated A2A adenosine receptors. Moreover, the increase in vein permeability required the activation of the Ca2+ channel TRPV4 downstream of Panx1 activation. Panx1-deficient mice resisted the pathologic effects of sepsis induced by cecal ligation and puncture on life span and lung vascular permeability. These data provide a targetable pathway with the potential to promote vein barrier function and prevent the deleterious effects of vascular leak in response to inflammation.

A venous-specific purinergic signaling cascade initiated by Pannexin 1 regulates TNFα-induced increases in endothelial permeability