新型コロナウィルス感染症を材料にして --- クローンウィルスをめぐって(12)

 

 Structural basis of ribosomal frameshifting during translation of the SARS-CoV-2 RNA genome

 Programmed ribosomal frameshifting is a key event during translation of the SARS-CoV-2 RNA genome allowing synthesis of the viral RNA-dependent RNA polymerase and downstream proteins. Here we present the cryo-electron microscopy structure of a translating mammalian ribosome primed for frameshifting on the viral RNA. The viral RNA adopts a pseudoknot structure that lodges at the entry to the ribosomal mRNA channel to generate tension in the mRNA and promote frameshifting, whereas the nascent viral polyprotein forms distinct interactions with the ribosomal tunnel. Biochemical experiments validate the structural observations and reveal mechanistic and regulatory features that influence frameshifting efficiency. Finally, we compare compounds previously shown to reduce frameshifting with respect to their ability to inhibit SARS-CoV-2 replication, establishing coronavirus frameshifting as a target for antiviral intervention. 

SARS-CoV-2ゲノム翻訳に際してのリボソーム・フレームシフトの構造的基礎．

[概要] プログラムされたリボソーム・フレームシフトは，ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼと下流タンパク質の合成がなされる，SARS-CoV-2 RNAの翻訳における主要なイベントである．ここで、我々は，ウイルスRNAにおいてフレームシフトを生じさせる哺乳類リボソームの翻訳のクライオ((極)低温)電子顕微鏡による構造を示す．ウイルスRNAは，mRNAにおいて電圧(電位差(?))を生じるためのリボソーム mRNAチャンネルへの入り口にとどまり，フレームシフトを促す，シュードノット(pseudoknot)構造を持っている．その一方で，最初の頃のウイルス・ポリプロテインは，異なったリボソーム・トンネル反応をする．生化学実験によって，構造的観察結果を確認して，フレームシフトの効率に影響する，機械的な調整特性が明らかにされた．最後に，SARS-CoV-2の複製を抑制する能力の観点から，フレームシフトを明らかに減じることが示された化合物を比較した．抗ウイルス干渉の標的としての，コロナウイルス・フレームシフトを明らかにする．

♪フレームシフト突然変異(frameshift mutation) --- 遺伝子DNA上で3の倍数でない少数個の塩基が挿入あるいは欠失することにより，その情報がタンパク質のアミノ酸情報として読みとられるとき， 読み枠にズレを生じるような突然変異．

♪ リボソーム(ribosome) --- 遺伝子情報の翻訳，すなわち，タンパク質生合成の場となる細胞内構造体．

♪ 開始コドン(initiation codon) --- mRNAがタンパク質に翻訳されるとき，タンパク質生合成の開始点となるコドン．一般にはAUGが開始コドンだが，GUGやUUGなど他のコドンが使われる例も知られている．AUGはメチオニンのコドンとしても用いられるので，特定のAUGを開始コドンとして決める機構があるが，一義的でないことも多い．

♪ 終止コドン(termination codon) --- ナンセンスコドンに同じ．mRNAがタンパク質に翻訳されるときタンパク質生合成の終止を指示するコドン．一般には，UAA(ochre codon, オーカーコドン),  UAG(amber codon, アンバーコドン)，UGA(opal codon, オパールコドン)がこれに相当し，これらの一つあるいは二つの組み合わせでタンパク質生合成の終止点が規定される．AGA, AGGが終止コドンとして使われている例も知られる．*点突然変異によってタンパク質をコードする塩基配列中に終止コドンが生じ，その結果C末端側を欠いた不完全なタンパク質が生合成されるような場合，それをナンセンス突然変異という．なお，終止コドンは，ペプチド鎖合成の終結という意味も持っている．

♪ プログラムされたリボソーム・フレームシフトやシュードノット構造は，『生物学辞典』には，項目がないので，ネットなどで検索．ウイルスmRNAのポリペプチド鎖の分解や解離，再合成に関わる変異が，そういう概念で構成されるということなのだろう．

♪ ポリペプチド鎖解離因子(polypeptide release factor, RF) --- mRNA上の終止コドンを認識して，リボソームからタンパク質を解離(単離とも)するタンパク質因子．解離因子，伸張因子，開始因子の中には，リボソームのA部位(A site),  P部位(P site)のtRNA結合部位に結合するものがあり，多くの部分で多点接触していて，形状がtRNAの一部と酷似しているものがある．このタンパク質とRNAの物質の差を越えた類似は分子擬態(molecular mimicry)と呼ばれる．翻訳の終結複合体はmRNAの5'ポリペプチド鎖の解離だけでなく，リボソームを解離させてmRNAを放出させる必要があり，そのための因子として原核生物ではRrf, 酵母ではeRF4などが発見されている．

♪ カセット(cassette) --- 転座によって置換可能な一続きのDNA配列をカセットと呼ぶ．

♪ 異数性(heteroploidy) --- 異倍数性に同じ．個体または系統が，その種に固有の基本数xの整数倍より１個ないし数個多い，または少ない染色体数を持つ現象．そのような生物個体を異数体(heteroploid)と呼ぶ．

 Ribosomal frameshifting, a process during which the reading frame of translation is changed at the junction between open reading frames 1a and 1b, is one of the key events during translation of the severe acute respiratory syndrome corona-virus 2 (SARS-CoV-2) positive sense single-stranded RNA genome. This programmed -1 translational frameshifting is conserved in all coronaviruses and is necessary for synthesis of viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp or Nsp12) and downstream viral non-structural proteins encoding core enzymatic functions involved in capping of viral RNA, RNA modification and processing, and RNA proof-reading. Although the translational machinery typically prevents frameshifting as a potential source of one of the most disruptive errors in translation, many viruses rely on programmed ribosomal frameshifting to expand and fine-tune the repertoire and stoichiometry of expressed proteins.

リボソーム・フレームシフト --- 翻訳の読み枠が，オープン・リーディングフレーム 1aと1bの結合部分で変わるプロセスは，重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2) プラス１本鎖RNAゲノムの翻訳に際して，重要なイベントの一つである．このプログラムされた -1 翻訳フレームシフトは，全てのコロナウイルスが持っており，ウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRpあるいはNsp12) および，ウイルスRNAのキャップ構造，RNA修飾，およびプロセシング，そしてまた，RNA校正の時に含まれるコア酵素機能をコードする下流ウイルス非構造タンパク質の合成にとって必要である．翻訳機構は，典型的には，翻訳の際の最も致命的なエラーの原因となりうるとして，フレームシフトを阻止するのだが，多くのウイルスは，発現タンパク質のレパートリや化学量を,  広げたり，微調整するために，プログラムされたリボソーム・フレームシフトに依存している．

 Programmed -1 frameshifting in SARS-related coronaviruses occurs at the slippery sequence U_UUA_AAC in the context of a 3′ stimulatory RNA sequence that was predicted to form a 3-stemmed pseudoknot structure, and in parallel was independently tested by our lab and others . The frameshifting occurs with high efficiency (25-75%) depending on the system used  and changes the reading frame to UUU_AAA_C (Fig. 1A). Consequently, two viral polyproteins are synthesized, one encoded by the ORF1a when frameshifting does not take place, whereas ORF1ab is expressed as a result of frameshifting. Translation of ORF1a produces polyprotein 1a ending with Nsp10 followed by the short Nsp11. On the other hand, when the frameshift occurs, the polyprotein 1ab is generated, which contains almost 2700 additional amino acids and in which the viral RdRp, Nsp12, is produced after Nsp10 as a consequence of translation in the -1 frame. A putative secondary structure element in the viral RNA that forms a loop upstream of the shift site has been proposed to play an attenuating role in frameshifting and is referred to as the 5′ attenuator loop. Maintaining the precise level of coronavirus frameshifting efficiency is crucial for viral infectivity, evidenced by the remarkable fact that mutation of a single nucleotide in the frameshifting region of the SARS-CoV-1 RNA results in a concomitant abrogation of viral replication. Therefore, the importance of 3-stemmed pseudoknot-dependent -1 ribosomal frameshifting for the propagation of SARS-related coronaviruses, a process that has not been seen to occur on any endogenous human transcript in human cells, presents itself as an opportune drug-target with minimal tolerance for drug-resistant mutations. 

SARS関連コロナウイルスにおけるプログラムされた -1 フレームシフトは，3ステム・シュードノット構造を作るよう予定された，3'刺激RNA配列の文脈での、スリッパリー配列U_UUA_AACで起こる． 我々のラボや他でも，並行して独立に，検査を行った．フレームシフトは，系に依存して，高い効率で起こり(25 - 75%)，読み枠をUUU_AAA_Cに変化させた．結果的に，2つのウイルス　ポリプロテインが合成され，一つは，フレームシフトが生じなかった時のORF1aでコードされ，他方，ORF1abはフレームシフトの結果として発現した．ORF1aの翻訳は，短いNsp11を伴うNsp10で終止するポリプロテイン1aを作る．他方，フレームシフトが生じた時には，ポリプロテイン1abが作られ，それは，2700のアミノ酸が付加され, -1フレームの翻訳の結果として，Nsp10の後に，ウイルスRdRp, Nsp12が作られる．シフト部位の上流ループを作る，ウイルスRNAにおける推定される副次構造要素は，フレームシフトにおける役割を減じていることが提案されており，5'減衰ループと呼ばれる．コロナウイルスのフレームシフト効率の厳密なレベルを維持することは，ウイルスの感染性に対して重要であり，SARS-CoV-1 RNAのフレームシフト領域における単一ヌクレオチドの突然変異は，それに伴って，ウイルス複製を停止する結果となるという注目すべき事実によって，証明された．それゆえ，SARS関連コロナウイルスの増殖，ヒト細胞におけるヒト内生的転写が見られていないプロセスに対する，3ステム シュードノット依存 -1リボソームフレームシフトの重要性は，薬剤耐性変異に対する最小限の寛容さで，それ自身，絶好の薬剤標的であることを示している．

 Due to its importance in the life cycle of many important viruses and coronaviruses in particular, programmed frameshifting has been extensively studied using a range of structural and functional approaches. The structure of a 3′ stimulatory pseudoknot in isolation or in context of the viral genome has been proposed recently by various groups using techniques that include molecular dynamics, nuclease mapping, in vivo selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE), nuclear magnetic resonance (NMR) and cryo-electron microscopy (cryo-EM). Furthermore, a ribosomal complex with a frameshift stimulatory pseudoknot from the avian infectious bronchitis virus was reported at low resolution. Here, to provide a structural and mechanistic description of the events during ribosomal frameshifting, we investigated mammalian ribosomes captured in distinct functional states during translation of a region of SARS-CoV-2 genomic RNA where -1 programmed frameshifting occurs. 

多くの重要なウイルス，特にコロナウイルスのライフサイクルにおけるそれの重要性のために，プログラムされたフレームシフトは，構造的および機能的アプローチを使った研究が広範になされてきた．ウイルスゲノムの脈絡での，あるいは，単離における，3'刺激シュードノット構造は，分子動力学，ヌクレアーゼマッピング法，プライマー伸長法で解析された，生体における選択的2'ヒドロキシル・アシル化(SHAPE), 核磁気共鳴装置(NMR)およびクライオ電子顕微鏡(cryo-EM)を含む技法を使い，様々なグループによって，最近，提案されている．さらには，鳥伝染性気管支炎ウイルスからのフレームシフト刺激(鼓舞)シュードノットを持つリボソーム・コンプレックスが，低解像度で報告された．リボソームフレームシフトにおけるイベントの，構造的，機械的な説明を得るために，プログラムされた-1フレームシフトが生じるSARS-CoV-2ゲノムRNAの領域の翻訳での，異なる機能的状態において捕らえられた哺乳類リボソームを調べた．

(目次)

・Structure determination of a frameshifting-primed ribosomal complex

　　　フレームシフトがセットされたリボソームコンプレックスの構造決定

・The pseudoknot causes ribosomal pausing prior to -1 frameshifting  

　　　シュードノットは，-1フレームシフトの前に，リボソームを休止させる

・The SARS-CoV-2 RNA pseudoknot specifically interacts with ribosomal proteins and 18S rRNA

　　　SARS-CoV-2 RNA シュードノットは，リボソームタンパク質および18S rRNAと特異的な作用をする

・Frameshifting efficiency depends on the position of the “0” frame stop codon

　　　フレームシフト効率は，"0"フレーム終止コドンの位置に依存している

・Nascent chain forms specific interactions with the ribosomal exit tunnel

　　　ナサントチェーン(ウイルスポリプロテイン)は，リボソーム脱出トンネルと特異的に作用する

・Inhibition of viral replication by a compound that targets the SARS-CoV-2 pseudoknot

　　　SARS-CoV-2シュードノットを標的とする化合物によるウイルス複製の阻止

・Conclusions  結論

 

Structure determination of a frameshifting-primed ribosomal complex  

フレームシフトがセットされたリボソームコンプレックスの構造決定

We captured a 0 frame, pre-frameshift ribosomal complex by introducing a stop codon in place of the second codon of the slippery site (U_UUA_AAC to U_UUA_UAA) (Fig. 1A) and adding mutant eukaryotic Release Factor 1 [eRF1 (AAQ)] that is unable to release the nascent polypeptide. Translating complexes were prepared in an in vitro translation reaction using an in-house generated rabbit reticulocyte lysate (RRL) system that supported efficient frameshifting in the previously reported range of around 50% according to dual luciferase experiments (see methods). The ribosomes were programmed with mRNA encoding an affinity tag and harboring a region of the SARS-CoV-2 genome that encodes proteins Nsp10 (C terminus), Nsp11 and the majority of Nsp12. Western blotting showed that when using the WT RNA template, frameshifting was efficient, while the stop codon mutation prevented frameshifting and led to ribosome pausing. This effect was further enhanced when eRF1 (AAQ) was present in excess over endogenous wild type eRF1 (Fig. 1B).

われわれは，0フレーム --- スリッパリ部位の２番目のコドンの位置に停止コドンを導入する(U_UUA_AAC をU_UUA_UAA), そして，ナサント・ポリペプチドを解離することはできないが，変異真核解離因子1[eRF1(AAQ)]を付加することによる，前フレームシフト・リボソーム複合体 --- を捉えた．翻訳複合体は，デュアル発光酵素実験によって(メソッドをみよ)，以前レポートされた50%のレンジのフレームシフト効率を示した，実験用ウサギ脱核網状赤血球ライセート(RRL)系を使って，試験管における翻訳反応において準備された．リボソームは,  親和性タグをコードする，そして，タンパク質Nsp10(C末端)，Nsp11およびNsp12の大部分をコードするSARS-CoV-2ゲノム領域に停留する，mRNAによってプログラムされていた．ウエスタンブロッティング法によって，WT RNAテンプレートを使うとき，フレームシフトは効率的であり，一方，停止コドン変異はフレームシフトを妨げ，リボソームを一時停止させることが示された．eRF1(AAQ)が，内生野生型eRF1を超えて過剰に発現しているときは，この効果は，さらに高められた．

The cryo-EM 3D reconstruction of ribosome-nascent chain complexes (RNCs) affinity purified from the reactions supplemented with eRF1 (AAQ) revealed two distinct ribosomal complexes captured in the process of translating the slippery sequence (figs. S1 and S2). One represented a termination complex that contained the ATP-binding cassette transporter 1 (ABCE1) known to be involved in termination and recycling together with mutant eRF1 interacting with the stop codon (fig. S3). The second reconstruction resolved translating 80S ribosomes containing P- and E-site tRNAs bound (fig. S2). This reconstruction at 2.2 Å resolution allowed us to build the most accurate structure of a mammalian 80S ribosome so far and directly visualize many protein and virtually all rRNA modifications identified for the human ribosome based on quantitative mass spectrometry and as interpreted in a recent human ribosome structure (20 21), consistent with the complete conservation of all modified residues between rabbit and human rRNAs (figs. S4 and S5; and tables S1 to S3). Importantly, this reconstruction also featured additional density at the entrance to the mRNA channel suggestive of a structured RNA, which after focused classification revealed a prominent density for a complete 3′ frameshifting stimulatory pseudoknot at the entry of the mRNA channel on the 40S subunit (Fig. 1, C and D). The resolution of this reconstruction ranged from 2.4 Å at the core of the ribosome to ~7 Å at the periphery, where the most flexible regions of the pseudoknot are located (figs. S2 and S6). Based on the high-resolution maps that allowed visualization of the codon-anticodon interactions and modifications in the tRNA (Fig. 1E and fig. S6, A and B), we could unequivocally determine that a Phe-tRNA(Phe) was bound at the P-site (22). The mRNA does not adopt any unusual structure in the A-site of the ribosome as was observed for the HIV-1 frameshifting sequence visualized on the bacterial ribosome (23). This implied that the ribosome is paused by the downstream pseudoknot located at the entrance to the mRNA channel such that the P-site tRNA interacts with the UUU codon just prior to the first codon, UUA, of the slippery site (Fig. 2A). 

eRF1(AAQ)を補足した反応から精製されたリボソーム-ナサント鎖複合体(RNCs)親和性のクライオ電子顕微鏡3D映像は，スリッパリ配列の翻訳プロセスにおいて捉えられた，2つの異なるリボソーム複合体を明らかにした．一つは，終端に含まれていることが知られており，停止コドンに作用する変異eRF1と一緒に再利用される，ATP結合カセット・トランスポーター(輸送体)1(ABCE1)複合体,  もう一つの映像は，P部位およびE部位tRNA結合を含む80Sリボソーム翻訳を解像した．この2.2オングストロームの解像度は，哺乳類80Sリボソームの最も正確な構造を作ることまでできる．多くのタンパク質および量的な質量スペクトル計測に基づいて，ヒトリボソームに対して確認された仮想的な全てのリボソーム修飾を直接に可視化した．最近のヒトのリボソーム構造において解釈されたような，ウサギとヒトのrRNAsの間の全ての修正された残基の完全な保存と一致する．重要なのは，この映像は，構造化RNAを想起させるmRNAへの入り口での追加的な密集を特徴付けていることである．そして，焦点を絞った分類を行ったのち，40SサブユニットのmRNAチャンネルの入り口での完全な3'フレームシフト刺激シュードノットに対する顕著な密集が明らかになった．この映像の解像度は，リボソームの核での2.4オングストロームから，シュードノットが最も適応性を高める範囲である，周辺の~7オングストロームの範囲にわたっている．コドン-アンチコドン相互作用やtRNAにおける修正の可視化が許される高解像度マップに基づいて，Phe-tRNA(Phe)がP部位で結合していることを明白に確認することができた．mRNAは，バクテリアのリボソームで可視化されたHIV -1 フレームシフト配列に対して可視化されたように，リボソームのA部位における通常でない構造には適合しない．このことから，P部位tRNAが，スリッパリ部位の最初のコドンUUAのちょうど前のUUUコドンと作用するように，mRNAチャンネル入り口に位置する下流シュードノットによって，リボソームが一時停止することがわかった．

The pseudoknot causes ribosomal pausing prior to -1 frameshifting

シュードノットは，-1フレームシフトの前に，リボソームを休止させる

The observation that the pseudoknot acts as an obstacle to slow down translation as the ribosome approaches the slippery site is mechanistically reasonable. Since the pseudoknot is a stable structural element in the mRNA, it will resist unfolding and consequently generate a back-pull on the viral RNA, resulting in an increased chance of -1 frameshifting as the tRNAs are translocated. A pause in translocation at a codon that precedes the slippery site, characterized by a >10 times longer occupancy prior to the slippage event, was observed in an analogous case of heptanucleotide -1 frameshifting on the bacterial dnaX gene using single molecule experiments (24). According to this model, it would be anticipated that a further round of translocation results in unwinding of Stem 1 of the downstream stimulatory pseudoknot structure. Consistently, in our structure of the eRF1 (AAQ)-bound ribosome that advanced one codon further along the mRNA, no clear secondary structure is visible at the entrance to the mRNA channel as the mRNA now becomes disordered at this position (figs. S1 and S3, A and B). 

シュードノットが，リボソームがスリッパリ部位に近づくにつれて，翻訳をスローダウンすることを示すための障害として振舞うことは，機構的には理にかなっている．シュードノットは，mRNAにおける安定構造要素だから，広がることに抵抗し，結果的に，ウイルスRNAに引き戻される．その結果として，tRNAsが移動するときの-1フレームシフトの機会が増える．すべりイベントに先立つa>10倍長い占有で特徴付けられ，スリッパリ部位の前にあるコドンでの移動の一時停止は，単一分子実験を使ったバクテリアdnXのヘプタヌクレオチド-1フレームシフトと類似のケースで観察された．このモデルから，移動がさらに生じることは，下流刺激シュードノット構造のステム1のもつれが解けた結果であると予想できる．mRNAに沿って，一つのコドンをさらに移動させる，eRF1(AAQ)結束リボソームの構造において，mRNAがこの位置で異常となるような，mRNAチャンネルへの入り口での明らかな副次構造は，一貫して，見えていない．

In order to investigate the slowdown of translation on the wild type slippery sequence, we performed disome footprint profiling, a method to identify translational pause sites through the analysis of transitory ribosome collisions (25–27) (see methods). Notably, recent studies using conventional ribosome profiling methodology reported a lack in monosome footprint coverage across the frameshifting region on the SARS-CoV-2 RNA (11, 28) – possibly because ribosomes in this area became trapped in temporary collisions. Moreover, the highly structured pseudoknot at the entry to the mRNA channel would likely preclude efficient trimming by RNase I, the enzyme used for footprint generation, further reducing efficient monosome footprint capture. Using a modified nuclease treatment protocol (see methods) that recovered monosome footprints from the frameshift region (Fig. 3, A and C), our experiments revealed that ribosome collisions occur as a result of ribosomal pausing at the same position that is observed in the structure of the pseudoknot-engaged ribosome (Fig. 3, B and D). Apparently, although the base substitutions creating a stop codon in the 3′ adjacent slippery site did not change the features of pausing, it increased the dwell time of the ribosomes at the pause site sufficiently to allow visualization in the cryo-EM experiment. 

野生型のスリッパリ配列の翻訳を調べるために，二染色体足跡プロファイリング，転位リボソームの食い違いを分析することで，翻訳の一時停止を定める方法を行った．従来のリボソームプロファイリング法を用いた最近の研究で，SARS-CoV-2 RNAを横切る範囲の１染色体の足跡の欠落が報告された．この領域のリボソームは，一時的な食い違いに捕縛されると考えられる．mRNAチャンネルへの入り口の高構造化シュードノットは，痕跡を生じるために使われる酵素であるRNase(RNA分解酵素) Iによる効果的なトリミングが妨げられているようであり，効果的な1染色体の足跡の捕捉をさらに減じている．われわれの実験から，フレームシフト領域から１染色体の足跡を回復させる，修正されたヌクレアーゼ処理のプロトコール(メソッドをみよ)を用いて，リボソームの食い違いは，シュードノットと結びつくリボソームの構造に観察される同じ位置でのリボソーム一時停止の結果として生じることがあきらになった．明らかに，3'隣接スリッパリ部位における停止コドンを作る塩基の置換は，一時停止の性質を変えないが、クライオ電子顕微鏡実験で可視化するのに十分な一時停止部位でのリボソームの滞留時間を増加させる．

The results of our disome profiling experiments prompted us to structurally investigate disomes by cryo-EM. We were able to visualize the pseudoknot-paused ribosome followed by a closely trailing ribosome. Upon focused refinement, we obtained a high-resolution (3.1 Å) structure of the trailing ribosome in a rotated state (fig. S1). In congruence with our estimated positioning of the ribosomes in disome profiling (Fig. 3D), the purine-pyrimidine pattern of codon-anticodon pairs in the structure of the colliding ribosome revealed that the pause occurs with CCC and AUG triplets in the P- and A-sites, respectively (Fig. 3C). 

2染色体プロファイリング実験の結果を受けて、われわれは，クライオ電子顕微鏡を使って，2染色体を構造的に調べた．はっきりと跡を残すリボソームに続いてシュードノット休止リボソームを可視化できた．焦点を絞った改良をして，回転状態の痕跡を示すリボソームの高解像度(3.1オングストローム)の構造を得ることができた．2染色体プロファイリングにおける推定的な位置に合致して，食い違うリボソームの構造において，コドン-アンチコドンペアのプリン-ピリミジンのパターンは，一時停止が，P部位およびA部位において，それぞれ，CCCおよびAUGのトリプレットで生じることを明らかにした．

The SARS-CoV-2 RNA pseudoknot specifically interacts with ribosomal proteins and 18S rRNA

SARS-CoV-2 RNA シュードノットは，リボソームタンパク質および18S rRNAと特異的な作用をする

The intermediate local resolution (5-7 Å) of the cryo-EM map in the area of the pseudoknot allowed us to visualize the overall fold of the RNA and readjust its previously predicted secondary structure (14–17, 19) (Fig. 1, C, D, and F).

シュードノット領域のクライオ電子顕微鏡マップの中間的な局在解像度(5-7オングストローム)は，RNAの全フォールド(折り畳み)を可視化することができ，それの予め予定されている副次構造を見られるようにできる．

The stimulatory pseudoknot forms an H-type pseudoknot with Stem 1 and Stem 2 coaxially stacked on top of each other to form a quasi-continuous helix, while Stem 3 stands out almost perpendicular to this plane (Figs. 1D and 2B).

刺激シュードノットは，ステム3がこの平面にほとんど垂直に突き出ている間，亜連続な螺旋を作るために，互いの上に同軸状に重なった，ステム1およびステム2を持つH型のシュードノットを作る．

This corkscrew-like formation provides a bulky and well-structured obstacle wedged at the mRNA entry channel, having the potential to resist unwinding by the helicase activity of the ribosome and generating tension on the upstream mRNA up to the decoding center. Stem 1 of the pseudoknot forms a 9 bp helix which is GC rich at the bottom (Fig. 1F).

リボソームのヘリカーゼ活性によってもつれを解くことに抵抗する能力を持ち，解読中心までの上流mRNAが不安定になれば，この螺旋様の形態は，RNA参入チャンネルに差し込まれて，大きな，十分構造化された障害物となる．シュードノットのステム1は，底面で豊富なGCである，9bp(base pair)ヘリックス(螺旋)を形作る．

The penultimate nucleotides of the ‘spacer region’ prior to Stem 1 are located at the mRNA entry tunnel, where they interact with several basic residues in the C-terminal domain of uS3 on one side and are supported by uS5 from the other, with an additional weak contact contributed by the C-terminal end of eS30. uS3 and eS30 are primary components of the ribosome helicase and uS5 has been proposed to be a component of the ribosomal helicase processivity clamp at the mRNA entry site (29, 30).

ステム1の前の「区切り空間」の後ろから２番目のヌクレオチドは，mRNA参入トンネルに位置する．一方の側のuS3のC末端領域における，いくつかの基礎的な残基と作用し，eS30のC末端終端の寄与による付加的な弱い接触によって，他方の側からuS5で支えられている．uS3およびeS30は，リボソームヘリカーゼの主要な構成成分であり，uS5は，RNA参入部位での．リボソームヘリカーゼ効率促進クランプの構成成分であるという提案がされてきた．

The observed distance between the P-site UUU codon and Stem 1 of the pseudoknot underscores the critical dependence of the frameshifting efficiency on the length of the spacer region (31). Translocation to the next codon would place the frameshifting codon UUA into the P-site, with a simultaneous increase in the tension of the mRNA and unwinding of the GC-rich base of Stem 1 upon entering into the mRNA entry channel, comparable to the situation when the ribosome proceeds to the engineered stop codon as observed in our eRF1 (AAQ)-stalled structure (fig. S3). 

P部位UUUコドンとシュードノットのステム１の間の観察された距離は，区切り領域の長さへのフレームシフト効率の厳密な依存を明らかにする．次のコドンへの転位は，リボソームが，われわれの減速したeRF1(AAQ)構造において観察されるような，巧妙に操作された停止コドンへ進むときの状況と比較できる，mRNAの緊張が同時に増加し，mRNA参入チャンネルに入る場合のステム1のGCの豊富な塩基のもつれが解ける，P部位へフレームシフトコドンを追いやる．

The pseudoknot structure also reveals a hitherto unobserved and possibly unappreciated role for the distal site of the mRNA entrance channel in helicase activity. While mRNA unwinding studies outside the mRNA entrance channel have so far implicated only a helix in the C-terminal domain of uS3 (32), we notice that Loop 1 of the pseudoknot contacts the N-terminal domain of uS3 as well as the C-terminal tail of eS10 (Fig. 2B and fig. S6D), whereas the flipped-out base G13486 in this loop forms specific interactions (Fig. 2B). Furthermore, as the pseudoknot is located at the entry to the mRNA channel, helix h16 of the 18S rRNA is noticeably pushed outwards due to a direct contact with the minor groove of Stem 1 (Fig. 2B and fig. S7A). Since the pseudoknot wedges between the head and the body of the small ribosomal subunit, it would restrict their relative motions that need to take place during translocation. This is consistent with the studies on dynamics of coronavirus frameshifting, which revealed that the mechanism of -1 frameshifting involves restriction of small subunit head motion (33). 

シュードノット構造は，ヘリカーゼ活性におけるmRNA侵入チャンネルの末端部位に対する，これまで観察されなかった，そして，見過ごされてきた可能性のある役割も明らかにしている．mRNA参入チャンネルを除いたmRNAのもつれの解けを調べている間は，uS3のC末端領域におけるヘリックスにのみ関与していたが，シュードノットのループ1は，eS10のC末端尾部と同じようにuS3のN末端領域とも接触し，他方，このループにおけるflipped-out G13486は，特異的な相互作用を生じることに気づいた．さらに，シュードノットがmRNAチャンネルの入り口に位置するとき，18SrRNAのヘリックスh16は，ステム1の小さいわだちと接触するために，顕著に押し出される．シュードノットは，小さなリボソームサブユニットの頭部と胴体の間に割り込むのだから，転位の間に行う必要のある相互の動きを制限するだろう．このことは，コロナウイルスフレームシフトの動力学に関する研究と一致しており，小さなサブユニットの頭部の動きの制限を含む，-1フレームシフトの機構を明らかにした．

The structure also reveals another key aspect of the architecture of the pseudoknot as the ribosome encounters it. The start of the pseudoknot is shifted relative to the predicted secondary structure (14–17, 19) by two nucleotides. The two opposed nucleotides, which were assumed to base pair with Stem 1, are actually forming the start of Stem 3 by pairing with bases predicted to be in the single-stranded linker 2 (Fig. 1F and fig. S7, B and C). Our cryo-EM density reveals that Loop 3 accommodates a total of 4 nucleotides, three of which were originally attributed to Stem 2. Thus, we observe that Loop 3 is shifted and expanded relative to the initially predicted secondary structures (14–17, 19). 

この構造は，リボソームがそれと出会う時のシュードノットのアーキテクチャーのもう一つの重要な側面も明らかにする．シュードノットの始まる位置は，二つのヌクレオチドによって，予測される副次構造に比べてずれている．それらはステム１と対になる塩基であるとみなされているが，二つの相対するヌクレオチドは，実際，一本鎖リンカーの中にあるように予定された塩基と対になることによって，ステム3の始まりの位置を作っている．われわれのクライオ電子顕微鏡による密度から，ループ3は全部で四つのヌクレオチドを含み，そのうちの三つはもともとステム２のものであったことが明らかになった．そのため，われわれは，ループ3は，当初予測される副次構造に比べて位置がずれており，拡張していることを観察する．

To functionally support our structural findings and confirm the nature and specificity of the pseudoknot interactions, we performed structure-guided mutagenesis experiments using dual luciferase reporter assays in HEK293T cells (see methods) and monitored the frameshifting efficiency relative to the WT (Fig. 2C). Mutation of G13486 of Loop 1 to another purine reduced the frameshifting effi-ciency to 30% of the WT level, and mutation of this base to a pyrimidine further reduced frameshifting to 15%. As expected from our structural data, deletions of the nucleotides of the spacer regions also had a deteriorating effect on frameshifting. Loss of Loop 1 entirely abolished frameshifting. Deletion of a single nucleotide of Loop 3 in agreement with its proposed role in forming the base pairing interactions diminished the frameshifting rate to 25% of the WT level. Loss of the entire Loop 3 reduced frameshifting to 10% of WT levels. 

われわれの構造的な発見を機能的に補強し，シュードノット相互作用の性質や特異性を確かめるために，HEK293T細胞におけるデュアル発光酵素レポーター検査を使って(メソッドをみよ)，構造に基づく突然変異形成実験を行い，WT(wild type)と比較したフレームシフト効率を測定した．ループ1のG13486の別なプリンへの変異は，WTレベルの30%に，フレームシフト効率を減じた．そして，この塩基のピリミジンへの変異は，さらに15%フレームシフトを減らした．われわれの構造データから期待されたように，区切り領域のヌクレオチドの欠失もまた，フレームシフトへの効果を低下させた．ループ1の消失は，フレームシフトが完全になくなる．塩基と対をなす相互作用を作る際の提案された役割と合致する，ループ３の単一ヌクレオチドの欠失は，WTレベルの25%にフレームシフト率を減らした．ループ3の完全な消失は，WTレベルの10%にフレームシフトを減少した．

新型コロナウィルス感染症を材料にして --- クローンウィルスをめぐって(11)

前記事は，知らないうちに字数オーバーになっていて，勝手に消されていた部分があったので，私としては，ちょっと，残しておきたかった世間話の部分ではあったが，カットした．守護神獣ゴジラとかモスラとか，厚労省改革とか，解体とか．アニメっぽい想像として面白いのじゃないかと思ったり，社会的な話題としては物騒な話題というので，心残りではあるが，話題が，新型コロナだから，割愛した．

飲食店関係は，地元でも，お上からの飲食店向けの達しがあったのか，驚くほど新型コロナ感染拡大の初期から，営業自粛など，ニュースになっていたが，タチの悪いのは，半端な評論家まがいが色々とかき混ぜていたようだが，要は，対処しなければならないのは，ちょっとやっかいなウイルスだから，お調子こいているのじゃないか的な，いかにもコロナ専門家的な似非言論人が多いことではなかろうか．関心を向けること自体は，私は，いいことだと思っているが，橋本だのそのまんま東など，感染症の専門家なわけないじゃないか．むしろ，全くの素人で当然なキャラだから、おかしな反応狙いで，やっているのじゃなかろうか．私のような全くど素人とかつ知るもののないないものでも，意外と，新たな勉強になったから．有名人てこに，自己満足的な気分もわからなくはないが，正しいとは限らない．変な司法崩れまでコロナ参戦というのは、コロナわかっていないからじゃなかろうか．変異株への心配とコロナ慣れで人の動きがコントロールできないというのが流行りらしいが，変異株についても新宿だの人の流れも，それほど普段関心を持っているとは思えないが，話の種を作るのがうまいのだろう．

変異株の何が恐ろしいのかなどということは，ウイルス学の権威とかに任せるしかなさそうだが，私としては，想像だが，感染力や伝染力が強く，急性の症状が生じやすく，重症化率もどうやら高いらしく，年齢や性別による割合も変わってきているらしい，ということが言われているようだが，ほんとのところどうなのかは，日本の状況においては，あまりはっきりしない．ワクチンが効きにくくなる変異も生じているというので，人の免疫の仕組みに侵入して，より多くの細胞や組織に感染を広げるために，免疫反応を利用している向きもある．そういうことが，これまた，なんかはっきりしない．N501Y変異株だけに終わるのかどうかもはっきりしない．ウイルス感染の影響についても，副反応だけでなく，まだ，あまり話題にされない影響も存在している感じがする．そういうことが，今後の状況で，どのように現れてくるのか，そういう心配も考慮しているのなら，それ自体は，正しいのではなかろうか．免疫細胞間で行われるシグナル交換の仕組みを乗っ取って，ウイルスの進化のための環境づくりをさせている的なこともないとは限らない．もし，そういう環境が整ったら，変異株はどう進化するのだろうか．そういう脅威も，変異株の背後にあるということであれば，政策や社会の側の対策と，いわゆる科学的なエビデンスの確認が現在進行しているということになるのではないだろうか．海外では，早くから研究されているようだが，日本は，なんかカルトちっくな緩みが幅を利かす．

生体のミクロ環境でのウイルス感染免疫細胞の反応・応答は，予期せぬものがある．低線量の被ばくの影響は，リニア(線形)だろうという話であったが，被ばく元素の局在的影響から，がん化も生じる，という話に，ウイルス進化のメカニズムが似た面を持っている感じに思ったりする．ミクロな状況を見る解析装置として考えられそうだから．

現代科学は，およそ，実証科学なのだろうが，その過程で，いくつかの哲学的な世界観が生じつつ闘争し，構成的な場を作りながら，多様性の統一に向かって解体する．ミクロな世界は，そういう変動してやまない世界なのかもしれない．不思議なことに，SARS-CoV-2ウイルスの，異質な肺炎に始まり，免疫暴走に至る逡巡は，何か変動やまないミクロ環境の柔らかさを感じたりする．L452R(Leu(ロイシン) 452 Arg(アルギニン))も，アミノ酸が置換されただけのことを表すなら，N501Yと区別できる記号だという以外，何を知っているのだろうか．そして，知りうるのだろうか．神々の諍いを出し抜く運命を見出さねば，運命を切り開けない．「トロイの謀(トロイの木馬)」のように．発症の経緯がこれまでと違うとか，症状が長引いているとか，そういう特徴が，変異株の進化の原因となる可能性を高めるということならば，医療崩壊という事態は，自ら内堀・外堀を埋めた大阪城のようなものだろうし，堅固な城壁を自ら破壊して広げ，敵の侵入を許したトロイの城の油断であろうが，ギリシャからローマへの文明の解体と，混沌への序章ということになるかもしれない．トロイの遺跡でトロイの財宝を掘り当てたシュリーマンにまつわる神話的叙事詩ということで，ロマンも尽きないが，L452R変異株をつかんだのなら，どう歴史と運命に対峙するのか，面白そうな演劇である．なんちゃってであるが，私は，大根役者ばかりのコロナ劇場は見る気がしない．アイドル水着は見るかもしれないが．

これまで，NATUREやSCIENCE誌の閲覧フリーのレポートからつまみ食いしてきたわけだが，以下そういうことで，

"Circuits between infected macrophages and T cells in SARS-CoV-2 pneumonia" からつまみ食いして，

Our model proposes that SARS-CoV-2 initially infects and replicates in epithelial cells in the nasopharynx, which express relatively high levels of ACE2 compared with epithelial cells in lower airways or the distal lung. Whether by progressive movement distally in the tracheobronchial tree or via aspiration of nasopharyngeal contents, some virus gains access to the distal alveolar space. In the alveolar space, SARS-CoV-2 infects alveolar epithelial cells and tissue-resident alveolar macrophages. A transcriptional program that promotes the recruitment of memory T cells to the alveolar space is activated within infected tissue-resident alveolar macrophages. There, memory T cells become activated, releasing IFNγ, which activates tissue-resident alveolar macrophages containing SARS-CoV-2. Eventually, these tissue-resident alveolar macrophages die and monocyte-derived alveolar macrophages are recruited, which in turn become infected with SARS-CoV-2 to sustain the inflammatory signalling loop with T cells. These infected alveolar macrophages may act similarly to a ‘Trojan horse’,  transferring the virus to adjacent lung regions, slowly propagating SARS-CoV-2 infection across the lung.

我々のモデルでは，SARS-CoV-2は，まず，より深い気道あるいは肺遠位の上皮細胞に比べて，相対的に，ACE2の発現レベルが高い，上咽頭における上皮細胞に感染し，複製する．樹状の気管-気管支の遠位に向けて次第に動いていくか，あるいは，上咽頭に含まれる内容物を吸引して，幾らかのウイルスが，遠位にある肺胞空間に入り込む．肺胞空間の中で，SARS-CoV-2は，肺胞上皮細胞および組織定着型の肺胞マクロファージに感染する．メモリーT細胞の肺胞細胞への参入を促す転写プログラムが，組織定着性の感染肺胞マクロファージの中で活性化される．ここで，メモリーT細胞は活性になり，IFNγを放出し，SARS-CoV-2を含む組織定着型マクロファージを活性化する．結局，これらの組織定着型肺胞マクロファージは死に，単球から分化した肺胞マクロファージが参戦する．そして，今度は，T細胞と炎症信号を繰り返しやり取りするために，SARS-CoV-2に感染したものになる．これらの感染肺胞マクロファージは，「トロイの木馬」と似たような作用をし，ウイルスを近隣の肺領域に移動し，ゆっくりと，肺にわたって，SARS-CoV-2感染を広げていく．

Our model is informed by a wealth of causal data generated in cell and animal models of SARS-CoV-2 and the related coronaviruses SARS-CoV and MERS-CoV. SARS-CoV-2 proteins have been shown to suppress type I interferon responses, and we did not detect ongoing expression of type I interferons in our bulk or single-cell RNA-seq data. Our data suggesting that SARS-CoV-2 replicates in alveolar macrophages are consistent with reports that SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2 can infect macrophages in vitro, and the detection of SARS-CoV-2 in alveolar macrophages in autopsy studies of patients with SARS-CoV-2 pneumonia.

我々のモデルは，細胞で作られる豊富な通常のデータ，および，SARS-CoV-2および関連するSARS-CoVやMERS-CoVの動物モデルに基づいている．SARS-CoV-2タンパク質は，I型インターフェロン反応を規制することが知られており，我々の大部分の，単一細胞RNA-seqデータにおいて，進行中の1型インターフェロンの発現を探り出せなかった．肺胞マクロファージにおいてSARS-COV-2が複製されることを示す我々のデータは，試験管において，SARS-CoV, MERS-CoV, およびSARS-CoV-2は，マクロファージに感染できるという報告，および，SARS-CoV-2肺炎患者の解剖研究おいて，肺胞マクロファージの中にSARS-CoV-2が検出されたという報告によって支持される．

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We speculate that alveolar macrophages containing SARS-CoV-2 might spread virus between alveoli. For example, tissue-resident alveolar macrophages, once thought to be sessile, were recently shown to travel between alveoli through pores of Kohn, particularly during viral infection. In each new area of infection, positive feedback loops between alveolar macrophages containing the virus and activated T cells could promote persistent injury and inflammation.

SARS-CoV-2を含んでいる肺胞マクロファージは，肺胞間にウイルスを拡散していると考える．例えば，組織定着型の肺胞マクロファージは，その組織に固着しているものと考えられていたが，最近，近隣の肺胞壁にある個々の孔を通って，特にウイルス感染している間に，肺胞の間を移動することが示された．新たに感染した領域において，ウイルスを含んだ肺胞マクロファージと活性化されたT細胞の間の正のフィードバックループによって，しつこい損傷や炎症が促進されている．

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出典は例のごとくとして，

コア酵素(core enzyme) --- 酵素は一般に分子量数十万の巨大タンパク質であるが，大腸菌の酵素はα(分子量約4万)，β(同約15万5000), β'(約16万), σ(約9万)のサブユニットを持つ．２個のα，１個のβ，β'からなるα_2ββ’をコア酵素，α_2ββ'σをホロ酵素という．RNA合成の開始・伸長反応の活性中心はβサブユニットにあり，DNAとの結合には，β'が関与する．

UAS(上流転写活性化配列，upstream activating sequence)とURS(上流転写抑制配列, upstream repressible sequence)  --- これらのような調節配列は，DNA上にあって，遺伝子の発現を調整することからシス調節配列ともいわれる．

 

 Structural basis of ribosomal frameshifting during translation of the SARS-CoV-2 RNA genome .からつまみ食い．

 A putative secondary structure element in the viral RNA that forms a loop upstream of the shift site has been proposed to play an attenuating role in frameshifting and is referred to as the 5′ attenuator loop. Maintaining the precise level of coronavirus frameshifting efficiency is crucial for viral infectivity, evidenced by the remarkable fact that mutation of a single nucleotide in the frameshifting region of the SARS-CoV-1 RNA results in a concomitant abrogation of viral replication . 

シフト地点(部位)の上流ループを作る，ウイルスRNAにおける推定副次構造要素は，フレームシフトにおいて役割が減衰することが提示され，5'転写減衰ループ(領域)とみなされる．コロナウイルスのフレームシフト効果の厳密なレベルを維持することは，ウイルスの感染性に対して重要であり，SARS-CoV-1 RNAのフレームシフト領域における単一ヌクレオチドの突然変異は，それに伴って，ウイルス複製を停止する結果となるという注目すべき事実によって，証明された．

サーズは，変異によって，姿を消したが，SARS-CoV-2は，むしろ，不利となる変異を，うまく利用するかもしれない．ということも考えられるかもしれないという，話に繋がるだろうか．

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重症化の特徴として，IgM とか IgGとかの立ち上がり方が，通常の場合と異なるとかあったが，炎症反応の出方が通常と異なるとかはどうなのだろう．あるいは，そういう成果も踏まえて，重症化を防ぐ治療も考えられているのかもしれない．副反応を解析する準備が，はたして，あるのかとか，関わってくることになるのじゃなかろうか．因果関係がまだ，解明途中の問題も多いから，言いにくいのも分かる気がするが，もう少し，情報発信もあってもいい気がする．日本は，そういうことも十分でないまま，気分だけ煽る気配が多い気がする．

限られたデータあるいは少ない標本数から，データ・マイニングする手法を開発するとか，そういう話題であれば，ウイルス感染症などは，最初は確認例も少ないに決まっているわけだし，変異株，N501YとかL452R株とか騒がれるが，また，その後の動向も，十分なデータ待つ間に影響も実現しているわけだから，AI予想ぽく，目安を与えてくれるかもしれないが，おそらく，騒ぐ割には，遅れているか，やりたがらない状況が日本にあるのだろうと感じる．

口とか鼻や目から感染して，肺の奥の方に行って，症状を深刻化させたり，免疫暴走を助長するような機構が働く．当然，先ずは，ウイルスという異物を吸い込まない，そのリスクを下げるのに，マスクつけたり，換気に気をつけたり，人混みを避けたり，距離をとったりという，100%万全ということはないが，推奨する．

それを基本として，本当に酒が，そのリスクを増やす原因とか遠因になるのか，飲み屋でクダまくオヤジは，そのリスクはあって当たり前と判断し，VIP部屋で，飲食するセレブは，意味ないと主張する．しかし，感染力の強い変異株に主流が置き換わってきて，マスクは不織布マスクで，隙間が生じないように二重にする方がよく，飲食中も外さない方がいいということになり，VIP部屋でのセレブ女子会も，換気の行き届いた店に限るべきだということになれば、そういう話題，例えば，口パクマスクとか，が盛り上がることになるだろう．さらに，老人セレブは，誤嚥を起こしやすくなることも恐怖に感じなければならない．

もちろん，細やかな情報が提供されることは良いことだが，あげつらうだけで，どう対応したいのかあやふやな論調だけ立てて，コロナにも発言したつもり評論家の趣旨がわからない．あるいは，二階以上に老害なのかもしれない．本筋に修正されて，軽率な表現も手のひら返しすること自体は，いいことである．mRNAワクチンも，最初は，何処の馬の骨ともわからないワクチンという以外，大して情報提供されないまま，今では，予防、重症化阻止，あるいは，治療効果まで，90%をはるかに超える優秀なワクチンということで，できれば，ファイザー，モデルナ製で，という勢いだから，評論家の言う情報提供も，そこ自身が怪しいものである．もちろん，さりながら，心配というのか警戒感を持って臨むこと自体は，当然としても．

 

新型コロナウィルス感染症を材料にして --- クローンウィルスをめぐって(10)

次のSCIENCE誌掲載のレポートは，E484Kが中和抗体との結合をしにくくすることの代償変異としてN501Yを呼び起こすことも可能である，という様な，現在，懸念されている変異株に関する説明があったり，変異の系統的分岐・進化の考察とか，事前の擬変異株作成と実際に生じた変異との対応関係に関する話があったりするので，ページ数も少ないので，ちまちまと訳していこうと思う．欠失変異と置換変異の相補的な交叉進化という様なことも考えられるのだろうか．免疫不全を伴う長期患者のケースから，そういうことを探り当てる研究も，海外では，すでになされているということなのだろう．ここ一年で，私のブログも，新型コロナを巡っては，まだ(10)までしか進まないが，世界の先端研究は，生物学の未開領域にまで踏み込んでいるのだろうか．そいうことを思わせる(新たな発見とか，意外な手法の組み合わせとか)話も散在する場合が多くなっている感じはする．

The emerging plasticity of SARS-CoV-2

The evolution of SARS-CoV-2 poses challenges for vaccines and immunotherapies

By Kevin D. McCormick, Jana L. Jacobs, John W. Mellors

SARS-CoV-2の突然出現する柔軟性---SARS-CoV-2の進化は，ワクチンや抗体治療の脅威となりうる．

Viruses evolve as a result of mutation(misincorporations, insertions or deletions, and recombination) and natural selection for favorable traits such as more efficient viral replication, transmission, and evasion of host defenses. Newly selected traits may be linked in unpredictable ways and raise concern that virus spread and evolution could result in greater virulence (disease severity). The limited diversity of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) reported during 2020, ascribed to the 3'-5' exonuclease proofreading function of nonstructural protein 14 (nsp14), led to the view that vaccines based on a single sequence of the viral spike (S) protein, which mediates host cell entry, would likely generate immune protection to all circulating variants (1). However, variants of SARS-CoV-2 with mutations in S have emerged around the world, posing potential challenges for vaccination and antibodybased therapies. The continued spread of SARS-CoV-2 creates the opportunity for accumulation of additional consequential mutations in S and throughout the viral genome.

ウイルスは，突然変異(誤結合，挿入あるいは欠失，および，(遺伝子)組み換え)や，より効果的なウイルスの複製，伝播，および，宿主側の防疫への侵入というようなウイルスの望む特徴を自然に選択する結果として，進化する．新たに選択された特性は，予測できないあり様に結びついて，ウイルスの拡散や進化から，より強い毒性(重症化)をもたらす心配が生じている．2020年を通じて報告されている重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の変異が制限されている理由は，非構造タンパク質14(nsp14)の3'-5'エキソヌクレアーゼ(核酸分解酵素の一種)校正機能に帰せられており，宿主細胞への侵入の助けとなる，ウイルスのスパイク(S)タンパク質の単一配列に基づくワクチンが，全ての広まりつつある変異型への免疫防御を生じることはありうるという見方に導かれるが，Sに変異を持つSARS-CoV-2の変異型は，世界中で出現しており，ワクチン接種や抗体治療への潜在的な脅威となっている．拡大し続けるSARS-CoV-2は，Sおよびウイルスゲノムのあちこちで，さらなる重大な結果を生じる変異を蓄積する機会を作り出している．

Although SARS-CoV-2 shares high sequence homology with SARS-CoV, which caused the 2002–2004 SARS outbreak, the coronavirus family is diverse in both sequence and in host receptor preference. For example, SARS-CoV-2 and a “common cold” human coronavirus, HCoV-NL63, both recognize angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as the host cell receptor, but SARS-CoV-2 and HCoV-NL63 belong to different coronavirus genera and have major sequence and structural differences in the receptor-binding domain (RBD) of S,  sharing 2). This diversity in S indicates that coronaviruses have broad potential to tolerate changes in both sequence and structure without substantial loss of function. This may partially explain why coronaviruses can undergo zoonotic transmission and suggests that the full evolutionary potential of SARS-CoV-2 has yet to be revealed.

SARS-CoV-2は，2002-2004に流行したSARS-CoVと高い配列の一致を持っているが，コロナウイルスの仲間は，双方の配列においても，宿主受容体の参照においても異なっている．例えば，SARS-CoV-2とヒト``風邪''コロナウイルス,  HCoV-NL63は，双方とも，宿主受容体として，アンギオテンシン変換酵素2(ACE2)と結びつくが，SARS-CoV-2とHCoV-NL63はコロナウイルスの異なる属分類に属しており，主要な配列と，Sの受容体結合領域(RBD)に構造的な相違を持っており，30%以下の一致である．Sにおける多様性は，コロナウイルスは，機能を実質的に損なうことなく，配列および構造双方における変化に寛容である，広範な能力を持っていることを示している．このことは，なぜ，コロナウイルスが，人獣共通感染症の伝播を引き起こせるのかの，部分的な説明を与えるが，SARS-CoV-2の十分な進化能力は，未だ，わかっていないことを示唆している．

The S protein comprises two subunits: S1, which contains the RBD, and S2, which mediates virus–host cell fusion. Antibody-neutralizing epitopes are scattered throughout S but are mostly concentrated within the RBD. Despite the potential for plasticity, after nearly a year of spread (from December 2019) to >100 million people, there was limited evidence for evolution of SARS-CoV-2 S. The only notable evolutionary event was the D614G (Asp^(614) → Gly) substitution in S1, which increases ACE2 affinity, leading to higher infectivity and transmissibility. Viral sequences deposited in public databases were mostly obtained from the upper respiratory tract during acute infection, before major immune responses have occurred. Such sequences might not capture the effect of within-host immune selection on viral diversification. Extensive intrahost evolution of SARS-CoV-2 has been reported in at least five individuals with protracted infection because of immune impairment from therapy for hematologic malignancies or autoimmunity (3–7). They had active SARS-CoV-2 infection for an average of 115 days before clearing the infection or succumbing to COVID-19. Each patient also had at least one convalescent plasma (CP) treatment (intravenous transfusion of blood plasma from a donor who has recovered from COVID-19) and/or monoclonal antibody therapy. Some of these individuals were shedding high titers of SARS-CoV-2 at the time of discharge from hospital or before death, indicating the potential for transmission. SARS-CoV-2 variants from two of these patients had up to fivefold reduction in neutralization sensitivity to CP (3, 7). Although these are case studies in immunocompromised individuals, they raise concern because the deletions of amino acids 69 to 70 (D69–70), D141–144, or D242–248 in S1 were observed in four out of the five infections (3, 5–7); the N501T (Asn^501 →Thr) or N501Y (Asn^501 →Tyr) mutations were seen in two out of the five (5, 6); and the E484K (Glu^484 → Lys) and Q493K (Gln^493 → Lys) mutations in the RBD of one infection also arose in antibodyresistant viruses after in vitro selection.

Sタンパク質は2つのサブユニットを構成要素として持っている．S1は, RBDを含むものであり，S2は, ウイルス-宿主の細胞融合を成立させるものである．中和抗体の標的のエピトープは，Sのあちこちに散らばっているが，ほとんどはRBDに集中している．可塑的な面を持っているにも関わらず，(2019年12月以来)ほぼ一年後には，1億人を超える人々に広がったが，SARS-CoV-2 Sの進化については，限られた証拠しかなかった．唯一の顕著な進化イベントは，S1における，D614G(Asp (614)→ Gly)置換であり，ACE2に対する親和性を高めており，高い感染力と伝染力を持っている．公共のデータベースに収納されたウイルスの配列は，そのほとんどが，主要な免疫反応が生じる前の，急な感染発症時の上部呼吸器官から得られたものである．その様な配列は，ウイルスの多様性に基づく宿主側の免疫選択の効果を捉えられない．SARS-CoV-2の大きな宿主内進化(変異)は, 血液の悪性腫瘍や自己免疫疾患からの免疫低下が原因で感染の長引いた，少なくとも5例で報告された．彼らは，感染していない状態になる,  あるいは, COVID-19の死者になる前の平均115日間，SARS-CoV-2感染活性を持っていた．彼らは各々，少なくとも一つの回復期の人の血漿(CP)による治療(COVID-19から回復したドナーからの血漿を静脈輸血)，あるいは，モノクローナル抗体治療の双方あるいはそのどちらかを受けていた．彼らの幾人かは，退院時あるいは死亡する前に，SARS-CoV-2の高い滴定値を減じていたが，感染能力があることを示している．これらの患者の二人から得られたSARS-CoV-2変異株は，CPに対する中和感受性が5倍弱まっていた．これは，免疫障害を持つ症例のケース・スタディーであるが，S1におけるアミノ酸69-70欠失(D69-70), D141-144, あるいはD242-248 は，5人の感染者のうちの4人に見られた．N501TあるいはN501Y変異は5人中二人，および，一人の感染者のRBDにおける，E484KおよびQ493K変異は，試験管で淘汰した後の，抗体耐性ウイルスにおいて生じていた．

These reports preceded the detection of three major circulating variants—B.1.1.7, B.1.351, and P.1—which all contain at least eight single, nonsynonymous nucleotide changes, including E484K, N501Y, and/or K417N (Lys417 Asn) in the ACE2 interface of the RBD (shown in the illustration). There are also various deletions in the amino (N)-terminal domain (NTD) of S1 in B.1.1.7 and B.1.351 (see the figure). Although most of the mutations in these variants were observed in a minor fraction of SARS-CoV-2 sequences during the first year of the pandemic, including K417N, E484K, and N501Y, there is no evidence to suggest that these variants were created through sequential addition of each substitution during interhost transmission.

これらの報告は，それらはすべて，RBDのACE2インターフェイス領域におけるE484K, N501Y,および(あるいは)K417N(Lys^417 → Asn)を含むが，少なくとも8つの単一の，非同義的ヌクレオチド変換を含んでいる，3つの主要な流行変異株 --- B.1.1.7, B.1.351およびP.1 --- の検出に先行していた．B.1.1.7およびB.1.351におけるS1のアミノ(N)末端領域(NTD)において様々な欠失が生じている．これらの変異株における変異のほとんどは，最初の一年を通じて，つまりパンデミックを通じて，K417N, E484K,およびN501Yを含めて，SARS-CoV-2の配列の副次的な部分に見られるけれど，これらの変異が，宿主内感染の間に各置換が配列に付加されることで作られることを示す証拠は存在しない．

Because only a few SARS-CoV-2 mutations were in circulation during most of 2020, it is likely that the three major variants are the result of selective pressures and adaptation of the virus during prolonged individual infections and subsequent transmission. All the case reports of individuals with extensive intrahost SARS-CoV-2 evolution indicated that they had been treated with suboptimal neutralizing antibodies (that is, the CP treatment did not neutralize the entire virus population). Whether or not antibody therapy played a role, it is likely that the same variants or variants containing new mutations will continue to emerge in different geographic locations as the result of intrahost selection and subsequent transmission. Indeed, other variants have been reported with multiple mutations in S1, including the lineages B.1.526 (detected in New York) and B.1.429 (which originated in California) containing a substitution in the RBD that is distinct from other variants; and B.1.525 and A.23.1 that are thought to have originated in Nigeria and Uganda, respectively (8) (see the figure). 

ほんのいくつかのSARS-CoV-2変異が，2020年の間に流行したのだから，3つの主要な変異株は，長期感染患者の間での選択的圧力やウイルスの順応および継続的な感染の結果と考えられる，宿主内SARS-CoV-2進化を持つ患者のケース報告すべてで，最適ではない中和抗体治療(すなわち，CP治療は，完全にはウイルス集団を中和しない)がなされていた．抗体治療の寄与にかかわらず，同じ変異型あるいは新たな変異を持つ変異型は，宿主内淘汰やそれに続く伝染の結果として，異なる地理的位置において出現し続けていると考えられる．事実，別な変異型と異なった，そして，B.1.525およびA.23.1は，それぞれ，NigeriaおよびUgandaで発生したと考えられているが，RBDにおける置換の含まれた(NeW Yorkで検出された)近縁株B.1.526および(Californiaで生じた)B.1.429を含む，S1に複数の変異を持つ，別な変異株が報告されている．

The individual phenotypic effects of the mutations in S1 are incompletely understood, but some initial clues are emerging. Substitution at position Asn501 with Thr or Phe increases affinity for ACE2 binding (9), and Tyr501 increases infectivity and virulence in a mouse model (10). Some circulating variants may have reduced sensitivity to neutralizing antibodies that bind to the RBD directly (attributed to triple substitutions of key amino acids in the RBD at the ACE2-binding interface: Lys417, Glu484, and Asn501) or to the NTD (conformational changes in the NTD are required for ACE2 attachment). More studies to correlate viral genotype and phenotype are needed.

S1における変異の個別の形質の影響は，完全にはわかっていないが，とりあえずの手がかりとなることはいくつか見つかっている．Asn(アスパラギン)^501のThr(トレオニン)あるいはPhe(フェニルアラニン)との置換は，ACE2結合親和性を高め，Tyr(チロシン)^501は，マウスモデルにおいて，感染性および毒性を高める．いくつかの流行変異株は，(ACE2結合インターフェイス領域であるRBDにおける主要アミノ酸の3つの置換,  Lys417(リジン(リシンに同じ)), Glu484(グルタミン酸), Asn501によるとされるが，)RBDに直接触接する，あるいは，NTD(NTDにおける立体構造の変換は，ACE2と接着するときに必要とされる)と結びつく中和抗体への感応性が低くなっている．ウイルの遺伝子型と表現型の関連をもっと調べる必要がある．

It is possible that mutations that reduce neutralizing antibody binding, such as E484K, may require compensatory mutations that restore infectivity, such as N501Y. There appears to be convergent association of mutations such as the triple RBD mutation (Lys417, Glu484, and Asn501) that evolved in two distinct lineages (B.1.351 and P.1). Moreover, E484K was also recently detected with N501Y in the B.1.1.7 lineage (11). D69–70 in S1 doubled the infectivity of SARS-CoV-2 pseudovirus, implying that the deletion may have been required to compensate for a mutation, D796H (Asp796 His), that reduced antibody neutralization sensitivity at a cost to viral fitness (7). The role of compensatory mutations is also supported by the emerging B.1.525 lineage that has both E484K (reduction in antibody sensitivity) and D69-70 (compensatory increase in infectivity).

E484Kのような，中和抗体との結合を弱める変異は，N501Yのような，感染性を回復する代償的変異を求めることができる．2つの異なる近縁株(B.1.351およびP.1)に進化した，3重のRBD変異(Lys417, Glu484, およびAsn501)は，一点集約的であるように現れる．さらに，最近，E484Kが，B.1.1.7近縁株において，N501Yとともに検出され，S1におけるD69-70は，SARS-CoV-2擬ウイルスの感染性を倍にした．このことは，欠失は，ウイルス適合性の犠牲で中和抗体の感応性を弱める変異，D796H(Asp(アスパラギン酸)796  His(ヒスチジン))，を償うように求められたのかもしれないことを意味している．代償変異の役割は，E484K(抗体感応性を弱める)およびD69-70(感染力を代償的に増加する)双方を持つB.1.525近縁株の出現によっても裏付けられる．

It is not yet known whether the complex mutational patterns observed in SARS-CoV-2 variants are linked on the same viral genome or represent mixtures of different variants within the same patient. Studies evaluating the linkage of these mutations in individual SARS-CoV-2 genomes using single-genome amplification and sequencing, as has been used to characterize genetic diversity of HIV-1 and other viruses, are needed to accurately assess the infectivity and phenotype of individual variants. A case report of intrahost SARS-CoV-2 evolution showed that SARS-CoV-2 can evolve multiple distinct lineages within the same individual (6).

SARS-CoV-2変異型に見られる複合的な変異パターンは，同一のウイルスゲノムに連結するのか，同一のタンパク質内での異なるバリアントの発現型の混合なのかは，まだ，わからない．単一ゲノム増殖およびシーケンシングを使った個別のSARS-CoV-2におけるこれらの変異の関連を評価する研究は，HIV-1や他のウイルスの遺伝子の多様性を特徴づけるために使われたように，個別の変異の感染性や表現型を正確に調べるために必要とされる．宿主内SARS-CoV-2進化のケース報告で，SARS-CoV-2が，同じ個体の中で，多数の異なる近縁株を進化させる(分岐させる)ことができることが示された．

Several studies suggest that the major circulating variants have reduced neutralizing sensitivity to CP and plasma from recently vaccinated individuals. For example, CP from individuals who were infected with the B.1 lineage (D614G-containing SARS-CoV-2) had varying reductions in neutralizing activity against live virus isolates of the B.1.351 lineage. Additionally, vaccine-elicited antibodies have reduced neutralization of pseudovirus containing the triple mutation in S1 (K417N, E484K, and N501Y) of the P.1 and B.1.351 variants (12). Pseudovirus bearing the deletions and mutations found in the B.1.1.7 lineage also showed reduced neutralization sensitivity, but titers of antibody were sufficient for complete neutralization of B.1.1.7 in sera from 40 individuals vaccinated with BNT162b2 (Pfizer/BioNTech) (13). Continued phenotypic assessments of emerging, rapidly spreading variants, including those with nonsynonymous mutations in S1 (NTD and RBD) and S2, to neutralization by CP and postvaccination sera should be a high priority to monitor possible effects on vaccine efficacy. Phase 3 trials of SARS-CoV-2 vaccines derived from a single S sequence have shown them to be highly effective in preventing infection with the initial SARS-CoV-2 variants, including those with the D614G mutation(14, 15). More recent data suggest that certain vaccines are less protective against the B.1.351 variant, although additional studies are needed. Studies showing reduced antibody sensitivities against new variants do not inherently prove that a vaccine is less effective. In addition to effector B cells (which produce neutralizing antibodies), there are numerous additional vaccine-induced responses of the innate and adaptive immune systems that may protect against infection and further viral immune escape. Conversely, there are uncharacterized mutations outside of S that could facilitate SARS-CoV-2 immune evasion.

いくつかの研究は，主要な流行変異型は，最近ワクチン接種した個体のCPおよび血漿への中和感応性を低下していることを示している．例えば、B.1近縁株(D614Gを含むSARS-CoV-2)に感染した個体からのCPは，B.1.351近縁株から単離した生ウイルスに対する中和活性を様々に低下していた．加えて，ワクチンによって作られた抗体は，P.1およびB.1.351変異型のS1における３つの変異(K417N, E484K, およびN501Y)を含む擬ウイルスの中和能力を低下させていた．B.1.1.7近縁株に見られる欠失や変異を持つ擬ウイルスもまた，中和感応性の低下を示したが，抗体価は，BNT162b2(ファイザー/ビオンテック)ワクチンを接種した40個体からの血清においてB.1.1.7の完全な中和に十分であった．CPおよびワクチン接種後の血清による中和に対する，S1(NTDおよびRBD)およびS2における非同義的な変異を持つものを含む，突如出現し，急速に広がった変異型の継続的な表現型の調査は，ワクチンの有効性に関する生じうる影響の調査のために高い優先度を有する．単一のSの配列から派生したSARS-CoV-2ワクチンの第三相治験は，D614G変異を持つ変異株を含む，最初の方のSARS-CoV-2変異株への感染を防ぐ高い効果を示した．より最近のデータは，いくつかのワクチンでは，B.1.351変異型に対する防御力があまりないことが示されたが，さらに調べる必要がある．新たな変異型に対する抗体感応性を低下させるという研究は，本来，ワクチンの効果がないことを証明するものではない．(中和抗体を作る)エフェクターB細胞に加えて，元々備わっている免疫への多くの付加的なワクチン誘発反応や，感染の防御やさらにウイルスの免疫逃避への適応免疫系が存在している．一方で，SARS-CoV-2免疫回避を助長する，S以外の，形質(表現型)のはっきりしない変異も存在する．

The growing evidence for the emergence of immune escape mutations in protracted SARS-CoV-2 infection and for multiple, rapidly spreading variants should raise broad concern and action. Reducing the spread of SARS-CoV-2 is most likely to prevent further selection of immune escape variants. This will require a coordinated and comprehensive global vaccination and prevention strategy. Partial roll-out and incomplete immunization of individuals leading to suboptimal titers of neutralizing antibody could promote selection of escape variants that negatively affect vaccine efficacy. Increased genotypic and phenotypic testing capacities are essential worldwide to detect and characterize circulating SARS-CoV-2 variants that may emerge from selection by natural or vaccine mediated immune responses. Infections that occur among vaccinated individuals should be aggressively evaluated for the mechanisms of breakthrough. The explosive, global spread of SARS-CoV-2 and the devastation it has wreaked is a stark warning of the potential for new variants to further complicate pandemic control. Vaccine manufacturers are now testing potential booster vaccines against circulating SARS-CoV-2 variants, and more broadly active monoclonal antibodies are in development for therapy. Such proactive approaches are likely to be needed to ensure pandemic control and elimination. 

長引くSARS-CoV-2感染における免疫逃避変異および複数の急速に広がる変異株に対する増大する証拠から，心配の向きが大きくなっており，それに対する行動も多くなっている．SARS-CoV-2の拡大を減じることができれば，さらなる免疫逃避変異の選択を妨げることに期待が持たれるが，世界規模での均等で広範なワクチン接種および防疫戦略が必要となるだろう．中和抗体の中途半端な抗体価を導く，部分的な接種や個体の不完全な免疫形成は，ワクチンの有効性に否定的な影響を与える逃避変異の選択を促進することになる．遺伝子型と表現型の検査キャパシティーを増やすことは，本質的には，世界中で検出を行い，自然なあるいはワクチン接種を媒介とする免疫応答によって出現するかもしれない流行SARS-CoV-2変異株の特徴を明らかにすることである．ワクチン接種した個人の間で生じる感染は，全く新たな機序として評価すべきである．SARS-CoV-2の爆発的な，世界規模の拡大および弱まっている対抗力は，さらにパンデミック制御を難しくする新たな変異能力に対する明らかな前兆である．ワクチン製造は，現在，流行SARS-CoV-2変異株に対して補強されたワクチンの性能を検査しているところである．そして，さらに，広範な活性モノクローナル抗体が治療用に開発されているところである．そのような事前の取り組みは，パンデミック制御や終結を確かなものにするために必要であると思われる．

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変異株系列では，分岐もするのだろうが，それらの間の遠近関係が，どういう形質に基づくのかとか，非形質的な影響もあるのかとか，おそらく，mRNAワクチンでは，そこらの事情をワクチンのデザインに柔構造的に取り込む新手法も使われているのではないかとか，正確な評価は専門家に任せるしかないが，mRNAワクチンでは，巷で言われるよりは，進んだ配慮が科学的に検証されているのだろう．そういう印象も生じる．コロナウイルスに広範に当てはまるものと，新型コロナウイルスの変異型として生じうるバリエーションへの適応限界のせめぎ合いが，今後，ワクチンに耐性を持つ株が出現するのではないかという懸念ということで，東京の変異株(あるいは大阪の変異株)の動向が心配されているのだろう．

免疫に阻まれて，臓器の移植あるいは万能細胞のがん化という壁が生じて，治療や薬ができない病気に対して，新型ウイルスの免疫逃避変異の仕組みを利用できるようにする発見につながれば，変異株自体に対する心配事と新たな治療への希望が共存している事態．

結局，COVID-19対策のちぐはぐからもたらされる利益は，組織の闇の温存というところに流れる仕組みになっているのだろう．ヘンテココロナ論議もそのためのサインだと考えればわかりやすい．大阪の医療崩壊の利益もそこに流れるのだろうから，多分，成り行き任せでも支障はないのだろう．迷惑する人もいるが．多くの人の努力の成果も，そういう組織の闇に流れる．そこらをごまかす論調もはびこる．嘘の多いあるいは嘘まじえのも多いわけだから，腹が透けて見えるようなのも，画面には多く出演している．コロナ後は，もはや，見えている．

COVID-19の症状(重症化)についてもワクチンの効果についても，免疫反応のより具体的な，症例に基づく解明の重要性がより高まっているという趣旨のレポートが多い感じである．例えば，核フコース基欠損免疫グロブリンG(afucosylated IgG)という耳慣れない言葉から，フコースの説明には，細胞分化や細胞接着の機構に関わる糖鎖ということだが，core fucoseだから核フコースだろうし，afucosylated IgG は，

IgG lacking core fucosylation (afucosylated IgG) causes increased antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) through highly increased IgG-Fc receptor IIIa (FcγRIIIa) affinity.

核フコース基欠損IgG(afucosylated IgG)は，大きく増大したIgG-Fc受容体IIIa(FcγRIIIa)親和性を通じて，抗体依存性細胞障害活性(ADCC)増加を引き起こす．

核フコース基を欠いたIgGが，なぜ，ADCCを誘発するのかとか，細胞分化や細胞接着，免疫シグナルの伝達機能とか，どういう影響を受けるのかとか，多糖鎖の可変性とか，遊離とか，なかなか難しく感じる．膜に包まれたような，あるいは，類似の構造を持つ組織に高い順応性をエンベロープを持つウイルスは，そもそも持っているのかとか，どうなんだろうと思う．

宿主細胞とウイルス膜の融合接着から，スパイクSが，擬似ACE2受容体のようになって，それに結合しやすいように，ウイルス側のスパイクの一部が変異すれば，ウイルスは，鍵穴を取り替えるための仕組みを，宿主細胞膜の多様で潜在的な役割を利用して，宿主細胞膜上に作って，その作られた鍵穴は自分の一部のようなものだから，合鍵もたやすく作れ，感染，侵入効率も高まる．その副産物として，患者にどういう反応が生じるかは調べないとわからない．ということは，考えられないだろうか．拒絶反応に関わるアロ抗原(同種抗原，alloantigen)の汎性---ここでは，IgGの核フコース基欠損の特徴---に関わるというわけだろうから．抗原特異性は，わざわざ，抗体に標的付けさせるためのものでは，ウイルスの側から見れば，ないだろうから(相手の機構を利用するために，認識させて，その動きを自身のために利用することもあるかも知れないが)，ウイルス側の一種の防衛機構なのかもしれない．

ここまでで，約2万字である．ウイルス側と宿主側のキーとなる役割が，ダイナミックに流動化しそうな場面にまで，科学的な解明が進んできたということだろうか．

知ったか振りの大口叩いて無責任な，しかもそれも自覚できない，例えば，変異株は話題に出なかったから東京で500人以下，話題になったから100人以下で解除でリバウンドしないなどと，今でもいいわけだけに終始する連中を抱えた，メディアの中韓体質はあてにならないから，どうせ責任なんぞ取りようもなかろうが，自分の発言に矜持と自覚くらいは持てというつもりでいったのだが．そうでないのなら，薄腹黒い連中のメディア利用にしか見えないから．害悪の垂れ流しが，ここ一年以上，新型コロナに関して続いていたわけである．

実際，生物系の細かい話はお手上げだが，懸念される変異が，どういう仕組みで，また，ウイルスと宿主の間の作用の応答で生じるのかとか，例えば，ヒトにもともと備わっている免疫のための仕組みのどこに，ウイルスが介入・侵入してくるのかとか，あたりをつけるには，次のような，(閲覧フリーの)レポートから垣間見るしか手段がない．多糖とタンパク質の架橋構造とか，変異に関係するのだろうか．

Afucosylated IgG characterizes enveloped viral responses and correlates with COVID-19 severity

核フコシル(?)(フコース)基欠損IgGは，ウイルス膜を持つウイルスを特徴付け，COVID-19重症化と関連する．

Immunoglobulin G (IgG) antibodies are crucial for protection against invading pathogens. A highly conserved N-linked glycan within the IgG-Fc tail, which is essential for IgG function, shows variable composition in humans. Afucosylated IgG variants are already used in anticancer therapeutic antibodies for their increased activity through Fc receptors (FcgRIIIa). Here, we report that afucosylated IgG (approximately 6% of total IgG in humans) are specifically formed against enveloped viruses but generally not against other antigens. This mediates stronger FcgRIIIa responses but also amplifies brewing cytokine storms and immune-mediated pathologies. Critically ill COVID-19 patients, but not those with mild symptoms, had high concentrations of afucosylated IgG antibodies against severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), amplifying proinflammatory cytokine release and acute phase responses. Thus, antibody glycosylation plays a critical role in immune responses to enveloped viruses, including COVID-19.免疫グロブリンG(IgG)抗体は，病原体の侵入を防ぐのに重要な働きを持つ．IgG-Fc尾部において大きく保存されたN多糖鎖，これは，IgG機能に対して本質的であるが，ヒトにおいて様々に合成される．核フコシル基欠失IgGバリアントは，すでに，Fc受容体(FcγRIIIa)を通じたそれらの増大した活性に対する抗がん治療用抗体において使われている．ここで，核フコシル基欠損IgG(ヒトにおける全IgGのほぼ6%をしめる)は，ウイルス膜を持つウイルスに対して特異的に作られるが，一般的には，他の抗原に対しては作られない．これは，より強いFcγRIIIa反応を促すだけでなく,  サイトカインストームの発生を増大させ，免疫を媒介する病気を増大させる．軽症の患者ではそうでないが，重症COVID-19患者では，炎症性サイトカインの放出を増大させ，急性相の反応を増大させる，重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)に対する核フコシル基欠損IgGの高濃度化が見られる．したがって，抗体グリコシル基は，COVID-19を含む，エンベロープを持つウイルスへの免疫反応において，重要な役割を持っている．

<途中はしょって......>

Discussion

Our results show a pattern of afucosylated IgG1 immune responses against membrane embedded antigens such as surface membrane proteins of alloantigens on blood cells or on enveloped viruses (including attenuated enveloped virus vaccines that often complete their first round of infection). This contrasts with soluble protein antigens and nonenveloped viruses for which immune responses with high levels of IgG1-Fc fucosylation were consistently observed. Although there was afucosylated anti-N IgG in COVID-19 patients, this was no longer the case 1 to 2 weeks after seroconversion.

我々の結果から，血球細胞あるいはエンベロープを持つウイルス(多くの場合では，一回の感染で完成するが，毒性を弱めたエンベロープを持つウイルスワクチンを含めて)上のアロ抗原である膜表面タンパク質のような抗原を埋め込んだ膜に対する，核フコシル基欠損IgG1免疫反応のパターンが示される．これは，水溶性タンパク質抗原および高レベルのIgG1-Fcフコシル化を伴う免疫反応が安定して見られるエンベロープを持たないウイルスと対照的である．COVID-19患者のなかには核フコシル基欠損 抗N IgGが存在していたが，血清転換後1から２週間で，存在しなくなった

We hypothesize that antigen-presenting membranes are directly sensed by B cells by combining at least two signals provided by the B cell receptor and undescribed host receptor-ligand pair(s). This two-step mechanism would be essential for the production of long-lasting afucosylated IgG responses and would not be triggered by soluble proteins, internal proteins of enveloped viruses, or nonenveloped viruses (Fig. 5). Alternatively, differential antigen recognition may be more complex and require additional interactions from antigen-presenting cells, T cells, and/or cytokines. This notion is supported by anti-N SARS-CoV-2 responses occurring concomitantly with anti-S responses, which suggests that proximal factors in the lymphoid microenvironment can influence the response.

我々は，抗原を提示する膜は，B細胞受容体と, はっきりとしたことのわからない宿主受容体-リガンドの対で与えられる，少なくとも二つの信号を結合することで，B細胞によって直接認識されるという仮説を立てた．この二段階の機構は，長く持続する核フコシル基欠損IgG反応の産出にとって重要であり，水溶性タンパク質，エンベロープを持つウイルスの内部タンパク質，あるいはウイルス膜を持たないウイルスが原因となることはないだろう．あるいは，差次的抗原認識(選択的抗原認識)はさらに複雑で，抗原提示細胞，T細胞，あるいは(または)サイトカインからの，付加的な作用を必要とするのかもしれない．この考えは，抗S反応に付随しておこる抗N SARS-CoV-2反応によって支持される．それは，リンパ・マイクロ環境での近似的な因子が、反応に影響を与えることができることを示唆している．

This work suggests that providing foreign B cell antigens in the context of the host-cell membrane may be necessary but not sufficient to trigger an immune response with high amounts of long-lasting afucosylated IgG (17). This translates into varied Fc fucosylation levels between individuals as well as for distinct responses of the same individual against different antigens. The large difference in the number of antigen-specific afucosylated responses observed between patients contributes to the variability of disease severity, as has been shown for neonatal alloimmune cytopenias (12, 13, 17) and dengue (15). Here, we also show its importance for the pathogenesis of COVID-19. Thus, afucosylation may potentially help predict disease trajectories and guide future treatments aimed at minimizing this FcγRIIIa stimulus.

この研究から，宿主細胞膜側においては異物とされるB細胞抗原を与えることは，必要かも知れないが，大量の持続的な核フコシル基欠損IgGとの免疫反応を起こさせるのには十分でない，ことが示された．このことは，異なる抗原に対する同じ個体の異なる反応に対するのと同じように，各個体間で,  Fcフコシル化が様々にレベルが異なることによるとされる．患者の間で見られる多くの抗原特異的なフコシル基欠損反応における大きな違いは，新生児アロ免疫性血球細胞減少やデング熱で見られるように，重症化のしやすさに寄与する．ここで，COVID-19の発症に関しても，それが重要であることも示す．よって，フコシル基化欠損は，病気の経過を予想したり，このFcγRIIIa刺激を最小にする目的の将来の対処を導く助けとなりうるものかも知れない．

IgG-Fc afucosylation results in potent immune responses. Namely, FcγRIIIa-expressing natural killer (NK) cells, monocytes, and macrophages as well as FcγRIIIb-expressing granulocytes are triggered to destroy target cells. This response may be desirable in some responses, such as against HIV (16), and can be achieved with available attenuated enveloped viral vaccine shuttles (30) against targets for which vaccine-based approaches have failed. However, this phenomenon can also lead to an undesirable exaggerated response, as is the case for both dengue virus (15) and SARS-CoV-2. Attenuated virus vaccine ferrying spike proteins of SARS-CoV are known to produce strong antibody-dependent enhanced responses (31) mimicking pathologies in critically ill SARS-CoV-2 patients (21). This suggests that subunit protein vaccines may be a safer option, as seen in rat models for SARS-CoV-2 (32), unless the vaccine also induces a strong neutralizing effect that can contribute to enhanced protection. 

IgG-Fcフコシル化欠損は，強い免疫反応を引き起こす.  すなわち，FcγRIIIa発現ナチュラルキラー(NK)細胞，単球，および, FcγRIIIb発現顆粒白血球に加えてマクロファージが，標的細胞の破壊のために誘発される．この反応は，HIVに対するようないくつかの反応においては望ましいものかも知れない．また，ワクチンベースのやり方が失敗した標的に対して，利用可能な弱毒化エンベロープ型ウイルスワクチンを運ぶことで，達成できるかも知れない．然し乍ら，この現象は，デング熱ウイルスやSARS-CoV-2双方で見られるような，望ましくない過度な反応にも導く可能性がある．SARS-CoVのスパイクタンパク質を運ぶ弱毒化ウイルスワクチンは，重症SARS-CoV-2患者における病状によく似た，強い抗体依存性増強反応を作ることが知られている．このことは，サブユニットタンパク質ワクチンは，SARS-CoV-2ラットモデルで見られるように，ワクチンが，防御を高めるように促す強い中和効果もまた誘発しない限り，より安全な選択肢となりうることを示している．

The afucosylation of anti-S IgG may contribute to the exacerbation of COVID-19 in a subset of patients, resulting in ARDS. Thus, although they can be protective, antibodies potentially behave as double-edged swords and may contribute to the observed cytokine storm (33). As such, this has direct consequences for the development of improved intravenous Ig (IVIg), convalescent plasma, and vaccine therapies. In addition, the suggested role of afucosylated antibodies in the pathogenesis of SARS-CoV-2 may open up additional opportunities for the treatment of COVID-19. Thus, attempts to generate high-titer Ig treatments should preferably use plasma enriched in fucosylated anti–SARS-CoV-2 antibodies. This may avoid the escalation of symptoms and promote virus neutralization in patients, preferentially before developing afucosylated IgG responses.

抗S IgGのフコシル基化欠損は、ARDS(急性呼吸困難症候群)に陥った，一部の患者において，COVID-19の悪化を促す．よって，抗体は，それらを防ぐためのものであるが，あたかも諸刃の刃のように振る舞い，観察されているサイトカインストームを手助けしているかも知れない．これは，改善された静脈Ig(IVIg)治療、回復した人の血漿を使った治療、およびワクチン治療の開発の直接的な結果であるが，さらに，SARS-CoV-2発症における，フコシル基欠損抗体の示唆される役割が，COVID-19治療に対して加わる機会を上げていることもありうる．従って，高い値のIgを作る治療の試みは，フコシル化抗SARS-CoV-2抗体において豊富になった血漿をなるべく使うべきである．そうすることで，何よりも，フコシル化欠損IgG反応が悪化する前に，患者の症状がエスカレートするのを避け，ウイルスの中和を促進させることができる．

新型コロナウィルス感染症を材料にして --- クローンウィルスをめぐって(9-3)

Fitness of RDR variants is evident by their representation in the consensus genomes from patients, transmission between individuals and presence in emergent lineages. Initially documented in the context of long-term infections of immunosuppressed patients, specific variants transmit efficiently between immunocompetent individuals. Characterization of unique cases led to the very early identification of RDR variants that are escape mutants. Since deletions are a product of replication, they will occur at a certain rate and variants are likely to emerge in otherwise healthy populations. Indeed, influenza explores variation that approximates future antigenic drift in immunosuppressed patients (21).

患者からのコンセンサスゲノムにおけるそれらの表現から，個体および発生系統における存在の間で伝播される，RDR変異の適合が確かめられる．免疫の抑制された患者の長期感染を調べる中で最初に記録され，正常な免疫反応を持つ個体に，特定の変異が，効率よく伝播していった．ユニークなケースの特徴づけを行うなかで，逃避変異であるRDR変異のごく初期の認定がなされた．欠失は複製の産物であるので，一定の比率で生じ，変異は，また別な健康な集団でも発生するものである．実際，インフルエンザは, 免疫が抑制された患者において， 抗原ドリフト変異が近く生じると見られている変異が探求されている．

The RDRs occupy defined antibody epitopes within the S glycoprotein NTD. Selected in vivo, these deletion variants resist neutralization by monoclonal antibodies. Viruses cultured in vitro in the presence of immune serum have also acquired substitutions in RDR2 that confer neutralization resistance (22). Potent neutralizing responses and an array of monoclonal antibodies are directed to the RBD (18, 19, 23). A growing number of NTD directed antibodies have been identified (24, 25). Why antibody escape in nature is most evident in the NTD highlights a discrepancy and this requires further study.

RDRsは，S糖タンパク質 NTDのなかの定まった抗体エピトープを占めている．生体内で選択されて，これらの欠失変異は，モノクローナル抗体による中和に耐性を持っている．免疫血清が存在する中で，試験管において培養されたウイルスでも，中和耐性を与える，RDR2に置換変異が生じた．中和反応の能力および多種多様なモノクロナール抗体は，RBDに向けたものである．抗体に抵抗するNTDが多くなっていることが確かめられた．自然における抗体逃避がNTDにおける場合と相違があることは明らかであるが何故なのか，さらに研究が必要である．

Defining recurrent, convergent, patterns of adaptation can provide predictive potential. From viral sequences, we identify a pattern of deletions, contextualize their outcomes in protein structure and antibody epitope(s), and characterize their functional impact on antigenicity. During evaluation of this manuscript, multiple lineages with altered antigenicity and perhaps increased transmissibility have emerged and spread. These variants of global concern are RDR variants and include Mink Cluster 5 Δ69-70 (26), B.1.1.7 Δ69-70 and Δ144/145 (27), and B.1.351 Δ242-244 (28). Our analysis preceded the description of these lineages. We had demonstrated that identical/similar recurrent deletions that alter positions 144/145 and 243-244 in the S glycoprotein disrupt binding of antibody 4A8, which defines an immunodominant epitope within the NTD. Our survey for deletion variants captured the first representative of what would become the B.1.1.7 lineage. These real-world outcomes demonstrate the predictive potential of this and like approaches and show the need to monitor viral evolution carefully and continually.

順応の反復，集中，パターンを明らかにすることで，事前の対応が可能になる．ウイルスの遺伝子配列から，欠失のパターンを確かめ, タンパク質構造と抗体エピトープの中に，それらの産物を結びつけ，抗原性への機能的影響を特徴付ける．この原稿を評定している間も，おそらく伝染性を高めていると思われるが，変化した抗原性を持つ多くの系統が生じ，広がっている．世界的な関心事であるこれらの変異は，RDR変異であり，ミンククラスター 5 Δ69-70, B.1.1.7 Δ69-70およびΔ144/145, また，B.1.351 Δ242-244が含まれる．われわれの分析は，これらの系統の報告に先立って行われた．そのS糖タンパク質の位置144/145および243-244を改める，同じ/類似の反復欠失は、抗体4A8の結合を崩壊させ,  そのNTDの中に免疫優勢エピトープ(タンパク質で免疫した場合，より多くの抗体産生，より強いT細胞応答が生じる，特定のエピトープ)を定めていることを確かめた．われわれの欠失変異に関する研究は，B.1.1.7系統を作ることになる最初の代表例を捉えていた．実際の世界でこれらが生じたことで，これや類似のアプローチが，予見的な能力を持つことが確かめられ，ウイルスの進化を注意深くそして継続的に監視することの必要性が示された．

 

SARS-CoV-2 dependence on host pathways

SCIENCE  884.full.pdf

[Abstract]

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) first emerged in 2019, and its high pathogenicity, infectivity, and transmissibility have led to a global pandemic. Although several vaccines have been approved in different countries, most of  the global population currently remains unvaccinated because of disparities in vaccine distribution and limited manufacturing capabilities (1). Owing to a lack of treatment options (particularly in low- and middle-income countries), the slow progression of vaccination, and the emergence of SARS-CoV-2 variants that elicit reduced responses to vaccines, there is an urgent need to identify therapeutics to reduce COVID-19 morbidity and mortality. On page 926 of this issue, White et al. (2) demonstrate that the small-molecul drug, plitidepsin, which is approved to treat relapsed and refractory multiple myeloma, possesses antiviral activity against SARS-CoV-2 and may be a promising drug candidate for treating COVID-19.

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は，2019年に，最初，出現して，高い病原性，感染力，そして伝染力によって，世界規模のパンデミックとなった．いくつかのワクチンが，いくつかの国で承認されているが，現在，世界の多くの人々が，ワクチン配布の不均衡や生産能力の限界の理由で，ワクチン接種を受けていない．(特に，低所得，中所得国家において)治療の手段がないこと，ゆっくりとしかワクチン接種は進まないこと，ワクチンの引き出す効果を減少させるSARS-CoV-2変異株の出現によって，COVID-19への罹患や死亡を減少させるための治療を同じにする緊急な必要がある，この刊の926ページで，White et al. は， 再発性の難治性多発性骨髄腫の治療に認められている，低分子薬，plitidepsinは，SARS-CoV-2への抗ウイルス活性を持っており，COVID-19の有効な治療薬の候補となるかもしれないことを証明した．

In broad terms, treatments for viral infections can target the virus, host, or underlying symptoms of infection.  Antiviral treatments work by disrupting the viral life cycle. For SARS-CoV-2, the life cycle can be divided into three stages: host cell entry and trafficking, replication of the viral genome, and packaging and egress of new virions (3) (see the figure). Entry of SARS-CoV-2 into host cells occurs through receptor-mediated endocytosis or virion fusion with the cell membrane. Once in the cell, two polyproteins, pp1a and pp1ab, are translated from the RNA genome. These polyproteins are cleaved to generate nonstructural protein 1 (nsp1) to nsp16. The Nsps form the replication and transcription complex (RTC), which transcribes the viral genomic and subgenomic RNA (sgRNA). The sgRNAs encode structural and accessory proteins. Structural proteins traffic through the endoplasmic  reticulum-to-Golgi secretory pathway, where viral genomes are packaged to form budding vesicles, which are then  released as new virions by exocytosis.

広い意味では，ウイルス感染に対する治療は，ウイルス，宿主，あるいは，感染のもとでの症状に向けられる．抗ウイルス治療は，ウイルスのライフサイクルを破壊するように働く．SARS-CoV-2に対しては、そのライフサイクルは，3つのステージに分けられる --- 宿主細胞への侵入および輸送，ウイルスゲノムの複製，そして，膜で包まれて，新たなウイルス粒子として放出される(図を見よ)．SARS-CoV-2の宿主細胞への侵入は，受容体を媒介とするエンドサイトーシス(細胞が外部の物質を，細胞膜を小胞化し融合して内部に取り込む方式)，あるいは，細胞膜とのウイルス粒子の融合を通じて生じる．細胞内への侵入を果たせば，2つのポリプロテイン，pp1a,およびpp1abが，RNAゲノムから翻訳される．これらのポリプロテインは，切断されて，非構造タンパク質1(nsp1)からnsp16までを作る．これらのnspsは，複製-転写複合化合物(RTC)を形作っており，ウイルスゲノムおよびサブゲノムRNA(sgRNA)を転写する．sgRNAは構造的およびアクセサリータンパク質をコードしている．構造タンパク質は，小胞体-ゴルジ分泌路を通って輸送される．そして，そこで，ウイルスゲノムは，膜に包まれて，出芽小胞となる．そして，それは，エキソサイトーシス(開口放出)によって，新たなウイルス粒子として，放出される．

A common class of antivirals being tested in clinical trials against SARS-CoV-2 is nucleoside and nucleotide analogs, which inhibit viral replication when incorporated into the RNA by the RTC (3–5). Remdesivir is a nucleotide analog that is presently the only U.S. Food and Drug Administration (FDA)–approved antiviral for COVID-19 treatment and is recommended for use in patients requiring oxygen that is administered in a noninvasive manner (6). However, like other antivirals, it is most effective when administered early during infection, when individuals exhibit mild-to-moderate disease symptoms. Currently, remdesivir is given as an intravenous infusion, restricting its use to clinical settings. Hence, new antivirals with oral bioavailability, which are readily available and accessible to the general public, are needed to shorten the infectious phase and prevent further spread. Nucleotide or nucleoside analogs that can be administered orally, such as sofosbuvir (combined with either daclatasvir or ledipasvir), ribavirin, and favipiravir are being tested in clinical trials for treating COVID-19. Favipiravir has shown promise in a few open-label clinical trials for COVID-19, but more studies are needed to confirm its efficacy (3). Another way to disrupt viral genome replication is to prevent cleavage of the polyproteins that generate the RTC. Many clinical trials are examining if lopinavir and/or ritonavir, which target the SARS-CoV-2 3C–like protease that is responsible for cleaving the polyproteins (6), are effective. Other inhibitors in clinical trials include those that target viral entry and trafficking such as camostat mesilate and baricitinib (6).

SARS-CoV-2に対する臨床試験において検査される抗ウイルス剤の共通のクラスは，RTCによってRNAの中に取り込まれたとき，ウイルスの複製を抑制する，ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似物である．レムデシビルは，ヌクレオチド類似物であり，現在，U.S.食品医薬品局(FDA)がCOVID-19に対する抗ウイルス薬として唯一承認しているものであり，酸素吸入の必要な患者に，体を傷つけるようなことのないように投与されて使われることが推奨されているが，他の抗ウイルス薬と同様に，感染初期で，患者が軽症から中等症の症状を示すときに投与される場合が最も効果的である．今のところ，レムデシビルは，静脈点滴で投与され，臨床的設定環境での使用が制限されている．そこで，吸引式で効果のあるように調合された新たな抗ウイルス薬が，一般の人々がすぐに使えて手に入れやすくなるが，感染の期間を縮め，さらなる感染拡大を食い止めるために必要とされている．(daclatasvirあるいはledipasvirのどちらかとの組み合わせで使われる)sofosbuvir，ribavirin, およびfavipiravirのような，吸引式のヌクレオチドあるいはヌクレオシド類似物は，COVID-19治療薬としての臨床試験で検査されている．favipiravirは，COVID-19に対するオープンラベルでの臨床試験で有望な効果が示されたが，その効果を確認するために，さらに調べる必要がある．ウイルスゲノムを複製させないようにする別な方法は，RTCを生成するポリプロテインの切断を妨げることである．多くの臨床試験で，ポリプロテインの切断を担う，SARS-CoV-2 3C様プロテアーゼを標的とする，lopinavirおよびritonavir，あるいはそのどちらかが効果があるかどうかを調べている．臨床試験におけるその他の抑制剤は，camostat mesilateやbaricitinibの様な，ウイルス侵入や輸送を標的とするものが含まれている．

An alternative antiviral approach is to target host cell pathways that are essential for virus replication, such as protein synthesis. Viruses are completely dependent on the host for translation and have evolved a variety of ways to exploit this machinery for their use (7). In human cells, translation can be divided into four phases: initiation, elongation, termination, and recycling of the ribosome. Translation is initiated by binding of the 5′ cap on messenger RNA (mRNA) by the 43S preinitiation complex. This complex scans the mRNA for the start codon and recruits the 60S ribosomal subunit to complete the assembly of the ribosome and begin elongation. Viruses can mimic host mRNAs, which contain a 5′ cap, 3′ polyadenylated tail, and untranslated regions (UTRs) flanking the 5′ and 3′ end, to utilize the host translation machinery (7, 8). The SARS-CoV-2 proteins, nsp10, nsp13, nsp14, and nsp16, cap the 5′ end of viral RNA (3). Coronaviruses are known to down-regulate global host mRNA translation (8). SARS-CoV-2 nsp1 blocks entry of mRNAs into the ribosome, thereby preventing translation (9 - 11). Currently, it is unclear whether viral mRNAs are completely able to avoid suppression by nsp1 (10, 11). However, a reporter gene encoding a viral 5′ UTR demonstrated a fivefold increase in gene expression in comparison to one encoding a host cell 5′ UTR (10). Thus, SARS-CoV-2 commandeers the host translational machinery and is highly dependent on it to make its own viral proteins.

別な抗ウイルス剤の追求は，ウイルス複製に必要不可欠である，タンパク質合成の様な，宿主細胞の経路を標的とするものである．ウイルスは，翻訳を完全に宿主に頼っていて，使える機構を利用するためのさまざまな方法を進化させている．ヒトの細胞においては，翻訳は４つの段階に分けられる --- 翻訳の開始，延長、終了およびリボソームのリサイクル．翻訳は，43S翻訳開始前複合体により，メッセンジャーRNA(mRNA)への5'キャップ(構造)の結合によって始められる．この複合体は，mRNAをスキャンして，開始コドンを識別し，そのリボソームの会合を完成させるために60Sリボソームサブユニットを用いて，延長を始める．ウイルスは，宿主のmRNAを真似ることができて，宿主の翻訳機構を利用するために，５’キャップ，3'ポリアデニル化終端、および、5'および3'エンド側にある非翻訳領域(UTRs)を含んでいる．SARS-CoV-2タンパク質，nsp10, nsp13, nsp14, そしてnsp16は，ウイルスRNAの5'エンドにキャップ構造を作る．コロナウイルスは、宿主側のmRNA翻訳を全般的にダウンレギュレートとすることが知られている．SARS-CoV-2 nsp1は，mRNAのリボソームへの侵入を妨げる，よって，翻訳を妨げる．現在のところ，ウイルスRNAsが，完全に，nsp1による制御を逃れられるかどうかはわからない．然し乍ら，ウイルス5'UTRをコードするレポーター遺伝子は，宿主細胞5'UTRレポーター遺伝子に比較して，遺伝子発現が５倍に増えることが確かめられた．したがって，SARS-CoV-2は，宿主の翻訳機構を奪い取って，それ自身のウイルスタンパク質を作るために，宿主の翻訳機構に強く依存している．

White et al. convincingly demonstrate that plitidepsin, which targets the host eukaryotic translation elongation factor 1a (eEF1A), possesses antiviral activity against SARS-CoV-2. Treatment of mice with plitidepsin reduced viral lung titers and lung pathology upon infection to a similar degree as remdesivir. Expression of the structural protein, N, was also lower in plitidepsin-treated cells compared to remdesivir-treated cells despite similar amounts of N sgRNA in both cells. This is likely due to the inhibition of translation of N by plitidepsin. A concern and limitation of translation inhibitors are the potential toxicities arising from the systemic inhibition of host translation. However, the safety profile of plitidepsin is well studied as it has been tested in many cancer clinical trials (2). An open-label proof-of-concept clinical trial of plitidepsin, given intravenously, to treat COVID-19 has been completed (NCT04382066), and another translation inhibitor, zotatifin, is in clinical trials as an intravenous treatment for COVID-19 ( NCT04632381). Zotatifin inhibits the eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF4A) (2). Both phase 1 clinical trials aim to evaluate the safety of these inhibitors for use in patients with mild or moderate COVID-19.

White et al. は，宿主真核細胞内翻訳延長因子1a(eEF1A)を標的とする，plitidepsinは,  SARS-CoV-2に対する抗ウイルス活性を有していることの，かなり確からしい確認を行った．plitidepsinでのマウス治療は，レムデシビルと同程度に，ウイルス肺滴定値および感染による肺疾患を減らした．構造タンパク質表現，Nは，レムデシビル投与の細胞に比較して，plitidepsin投与の細胞で，双方の細胞におけるN sgRNAの量が同じほどであるにも関わらず，低下した．これは，plitidepsinによって，Nの翻訳が妨げられることによると思われる．翻訳抑制因子の関連物質や局限は，宿主翻訳のシステミックな妨害から生じる潜在的毒性であるが，plitidepsinの安全性の面は，多くのがん患者への臨床試験で検査されて．よく調べられている. 静脈治療でなされ，COVID-19を治療するための， plitidepsinのオープンラベルでの概念実証臨床試験は，完了していて(NCT04382066),  別な翻訳抑制因子，zotatifinは，COVID-19の静脈治療としての臨床試験におけるものである(NCT046302381). zotatifinは，真核細胞内の翻訳開始因子4A(eIF4A)を抑制する．双方の第1相臨床試験は，COVID-19の軽症および中等症患者にそれらの抑制剤を使う場合の安全性を評価する目的で行われる．

Another small molecule that modulates host translation is rapamycin, which is an orally administered drug that regulates kinases involved in host protein synthesis (12). Multiple clinical trials are underway to examine the efficacy of rapamycin in patients with mild to moderate COVID-19. The study of White et. al. suggests that translation inhibitors may have promise in treating patients with mild or moderate COVID-19. There are discernable advantages to targeting the host, which include creating a higher bar for viruses to develop resistance and a broader protection against diverse viral strains.

宿主側の翻訳を調整する，別な低分子は，吸引投与型の薬であるが，宿主側のタンパク質合成に含まれるキナーゼを制御する，rapamycinである．複数の臨床試験が，COVID-19の軽症から中等症の患者におけるrapamycinの効果を調べるために，進行中である．White et al. の研究から，翻訳抑制因子は，COVID-19の軽症から中等症患者の治療に有望でありうることが示された．宿主側の機構を標的にすることには認め得る利点があり，ウイルスの耐性の増大に対する高い障壁や，多様なウイルス株への広範な防御を作る．

Despite the rollout of vaccines in several countries, discovering antivirals to treat SARS-CoV-2 continues to be important. There are already concerns about the emergence of SARS-CoV-2 variants that may be less susceptible to the current vaccines. Moreover, new antivirals are needed if remdesivir-resistant SARS-CoV-2 strains emerge. Recent data indicate that plitidepsin maintains potent antiviral activity against the B.1.1.7 SARS-CoV-2 variant (13). Furthermore, many viruses rely on similar host pathways for propagation, leading to some antivirals having a broad spectrum of activity against multiple viruses (3, 6). Remdesivir was originally identified for treating hepatitis C and respiratory syncytial virus, but was ineffective. It was repurposed for use against Ebola virus, and now against SARS-CoV-2. This suggests that antivirals discovered in the race to treat COVID-19 may be useful for future epidemics.

ワクチンがいくつかの国で実施されているにも関わらず，SARS-CoV-2治療のための抗ウイルス薬を見つけ出すことの重要性は変わらない．現在のワクチンが効きにくくなるSARS-COV-2変異株発生への関心は，すでに生じている．さらに，新しい抗ウイルス薬は，レムデシビル耐性SARS-CoV-2株の出現のとき必要とされる．最近のデータでは，plitidepsinは，B.1.1.7 SARS-COV-2変異株に対する抗ウイルス活性能を維持していることが示されている．さらに，多くのウイルスは，増殖のために，宿主側の同じ経路を利用しており，そのことから，多様なウイルスに対する広範な活性を持ったいくつかの抗ウイルス剤に導かれるかもしれない．レムデシビルは，もともと，hepatitis Cおよび呼吸器多核体ウイルスの治療用として特定されたものであるが，有効ではなかった．それは，エボラウイルスおよび現在のSARS-COV-2用に目的が変わった．このことから，COVID-19治療薬開発競争で発見された抗ウイルス薬は，将来の流行で役にたつかもしれないことが示唆される．

・骨髄 --- 骨組織に囲まれた血球系細胞と間質細胞からなる柔組織．骨髄は細胞と繊維から出る細網組織で，細網の細かな隙間を自由に動き回る造血細胞が満たし，ここで造血が行われる．赤色骨髄にはさまざまな発生段階の造血・免疫系細胞にそれぞれ分化する細胞が見られる．骨髄で産生されるリンパ球はB細胞である．

・骨髄腫 --- ミエローマ．Bリンパ球の終末分化段階にある形質細胞の単クローン性増殖による腫瘍性疾患．骨髄腫細胞は，免疫細胞との細胞融合を行うことによって，目的とする単クローン性抗体の作製に利用される．

・ポリプロテイン --- 二つ以上のタンパク質が一本のポリペプチド鎖のままで合成されたもの．その後，タンパク質分解酵素で切断されて，それぞれ独立のタンパク質となって機能する．真核細胞を宿主とするウイルスに見出される．

「細網細胞」とか読むと，脳の活動に関することではないのだが，なんか，脳のシナプスが，免疫などの影響をパネル化して，信号化している様な変な感覚に襲われる．骨髄腫は，60歳以上に多く，全身倦怠感や腰痛が多いとあるから，ウイルスが，独自な，網状の信号処理や伝達の骨格構造を宿主がわに形成するようなこともあるのだろうか．腰痛も倦怠感も感じることはあるので，治りにくいし，自己診断用に考えてみた．

吸引式守護神獣ゴジラの新生が待たれる感じになったが，どうなんだろう．

ヒト-ヒト感染に重点をおいた新型コロナに関する見方から，そもそもコウモリ起源ということもあるのだろうが，最近，人獣共通型のウイルスという面への言及が多い感じがする．人獣共通型から，これまでのワクチンや治療薬の限界を超える様な変異株の発生が懸念されるのか，人獣共通型の探求から，汎因子を抜き出して，治療薬や特効薬特定の戦略に乗せる作戦なのかということが考えられるが，どうなのだろう．

新型コロナの原因ウイルスとか，その作用である症状とか，ウイルス自体の変異とか，それらがもたらしているかもしれないウイルスやその作用の微妙な様相の変化とか，後追いするだけでも，めまぐるしい．対策面や，経済社会，文化面への影響に関しては，深く掘り下げて考えることも少なかったが，大方の報道や評論家もどき連中も，大概，無責任な言ったふりカッコつけ発言をしていたわけだが，全体的には，混乱は，総じて少なかったことは幸いである．政策側のお手盛りやご都合や業者癒着忖度で，やけに楽観論だのタイミング論だのお手盛りヤラセ演出報道に走る気配も生じたが，概ね，冷静な判断が視聴者の方に優っていたのだろう．

経済面では，一部の企業はV字回復，過去最大益とか，株価は外国投資家主導でバブル崩壊前の高値水準に迫りつつあるとか，コロナは関係なさそうだが，鬼滅のアニメが大ブームとか，その裏では，コロナ苦の蔓延とか，といって，表面的な話が多くて，これといって，信ぴょう性のある話としては組み立てられていない，お決まり評論が幅を利かすとか．

別に，経済でも社会でも，関心持って悪いわけでもなかろうのに，偏向した自粛気分便乗なのか，どっかの意向で，そうしたいのかが，透けて見える感じになっている．私は，気分は自粛しないが，世界的パンデミックも，COVAXも，ミャンマーの軍事クーデタでも，旧政財界の意向なのか，中韓関係のメディア工作員のせいなのか，中国がらみの，あるいはそいう関係の銭がらみの，情報統制がかった息苦しさを感じる．中国式の皇帝ボンボン気取りの悪意が蔓延している感じの論調も目立つ．しょうもないのが、小姑いびりみたいに，アンチをきどる.  継子扱いの企みを蔓延させる. そういう世界がどっかにあるのだろう．皇族関係だろうか．単なる，組織詐欺の詐欺チョン共謀に感じる事案も多くなってる感じがする．中朝韓体質なのだろうか．その程度の社会である．コロナ禍で退学者も出てるらしいが，コロナでゼニ困るようなところの学生は，自業自得だから，いなくなろうと問題にする意味がないというのが，今の学業というものである．ネットで勉強する方が実があるとしても，大学は旧態依然の器なし学者気取りの器なしの巣窟なわけだから，本音そうなるのである．変に持ち上げられるのに限って，そういうのが多い．天下りか、当て馬か，だらけた飼い犬かだけだから．オリンピックも、そういうみな慣れた連中のチワ騒ぎにしか見えない．ゼニと騙し目当てなのだろう．ちょいワル気分で盛り上がればいいのである．そいう予定でいればいいのである．そうでなければ、国民総オリンピック反対運動すればいいのである．一部の金銭詐欺と愚民国民カモ化活動だからという理由で．関係者の顔に出てるから．もちろん，森前会長の顔であるが，としておいて、来賓席だけ注目浴びるスポーツなど大人のやらせスポーツ大会である．北朝鮮もどきの体質の国の大会は，海外の選手も拒否すればいいのである．

おそらく，そういう状況も変わっていくのだろうが，一見静かな激動を抜け出すのは，結構，エネルギーがいるかもしれない．

医療現場の体制というのは，私のような部外者には解りようもないのだが，例えば，エクモのような呼吸器機能不全に対応する装置から，自動的に色々なデータが，記録され管理されて，後に，そのデータから，病原や免疫応答やシグナル系に対する意外な発見に役立てるようなことも可能なのだろうか．医療関係のデータベースとして，機能しているのだろうか．無症状から，軽症，中等症，重症，および，死亡に至る症状について，それぞれに，解明が進んでいるのだろうが，解明の途中であることには変わりないだろうから，変異株への懸念も，結局，どういう症状やあるいは症状等の様相の変化につながるかは不明というわけだから．「変異株への心配」と言われても，何が心配なのかどうかさえわからない中で，心配な気分の共有だけを言いたてていることになる．

よく言われることだが，確率的には，コインを投げて表が出るか，裏が出るかの確率は，どちらも1/2だが，実際，コインを投げて，表か裏かを確かめた時点では，その試行の結果については，0か１のどちらかだから，確率が安心を保証するわけではない．最近，そういうイロハも，弁舌達者ぶる連中の中には，政治家とか素人評論家とか，理解してないような論調があるようである，なんてな．科学的な根拠に基づいた，対策や政策，政治的行動が求められるといいながら，科学的根拠自体を，経済優先というので，経済がまるで軽い新興宗教気分かのようにまぎらかす．そんな議論だけが，メディア都合か，政財官の内部事情かで垂れ流される．緊急事態宣言の効果どうかより，そっちの方が，わけわからない論理である．そんな危うい論調が，メディア等で盛に垂れ流される中，大きな混乱にならないのは，幸いに，国民の，政治や言論界への不信が，的を得ているからである．政治不信などといいながら，言論半グレじみた変な連中を信頼するより，不信に立って行動を決めている効果である．いい効果であるが，言論界には，まだ依然，古き良き接待係ジャーナリスト特権気分が，温存されているのだろう．

ここ最近では，ファイザーやモデルナのワクチンの方が，国産ワクチンより，まして中国産ワクチンより，信頼性も高くなっているようであるが，森前会長や二階幹事長あたりが，間に合わせに，中国製ワクチンを接種して見せれば，効果とか，副反応とかは，どうせどうでもいいことなわけだから，オリンピック開催には貢献するのではなかろうか．実際には，若いアスリート中心だろうから，早めに，政界の重鎮に優先接種してもらう方が，いいのではなかろうか．オリンピック開催・参加が接種を前提としなくても，ちょとしたカルト気分の安心感は広がる可能性はある．運悪くなければ．科学的根拠と言われると，ちょっと怪しいが，話としては筋の通った話ではなかろうか．国民への押し付け話程度には．野田とか高市とかの女性議員も，中国製ワクチン大合唱しそうな勢いになりそうで、なりそうもないが，変な状況である．

NATURE誌にある"Circuits between infected macrophages and T cells in SARS-CoV-2 pneumonia"から，拾い読み的に，

Although tissue-resident alveolar macrophages are poor antigen-presenting cells and do not convert naive T cells into effector T cells, a low level of antigen presentation by alveolar macrophages might be sufficient to activate pre-existing memory T cells that cross-react with SARS-CoV-2. Existence of such cross-reactive memory T cells has been reported for SARS-CoV and for SARS-CoV-2.  A larger number of SARS-CoV-2 cross-reactive memory T cells was observed independently in elderly people and in patients with severe COVID-19, compared with those with mild COVID-19.

生体組織定着型の肺胞マクロファージは，抗原提示力の弱い細胞であり，元来のT細胞をエフェクターT細胞に変えないが，肺胞マクロファージによって提示される低いレベルの抗原は，SARS-CoV-2と交叉反応する，既に存在するメモリーT細胞を活性化するのには十分である．そのような交叉反応メモリーT細胞は, SARS-CoVおよびSARS-CoV-2に対して報告されている．軽症COVID-19患者と比較して，より多くの数のSARS-CoV-2交叉反応メモリーT細胞が，年配者や重症COVID-19患者にそれぞれ別々に観察されている．

マクロファージには遊走性(free)のものと，定着性(fixed)のものがあるから, そこの区別のことかなと思った．免疫暴走のメカニズムに関するレポートのようだから，サイトカインであるインターフェロンIFNγ(IFN II型)の，それの原因としての特定ということなのだろうが，以前ちょっとずつ報道されていたような内容の答えを示しているような感じである．そういうレポートも多くなっている感じだが，あまり日本では取り上げられない感じがする．そいう時は，政治都合や声高い世論をつくった格好にして，紛ら化されることが多い気がする．ちょっと，カルトのやり口の感じを受ける．

自粛ストレスが夜の街に多く，リモートがなぜ不都合なのか，生活パターンの中に形作られた，羽目外しや対面講義の中に滲み込んだ立ち位置が取りにくいからということなのだろう．人好きな連中ほどストレスが高まるのだろうか．私は，ひと気はちょっとうざく感じる方だから，通常に戻ったら，また，うまく距離をはかるためのストレスがかかるかもしれないが無視されることだろう．

去年のはじめの頃は，市中感染の拡大がだいぶはっきりとしていた頃，マスクは，60枚セットの一箱200円ぐらいのが売られていたのを２箱買っていたのだが，習慣がなかったからマスクなしのことも多かったのだが，スーパーとか行くとだいぶマスク着用が進んでいて，以来少しづづ気を使うようになって，現在まで，マスクは着用しているが，買い占めで入手しにくくなった時期も，別段，支障はなかったが，やっぱ，買い占めだのどっかの業者がやってるんだろなと思ったものである．そんなこんなの中で，SARS-CoV-2にもCOVID-19にも色々な解釈が賑わい，いい年寄りも，その受け止め方は千差万別だったろうが，それでも，ちょっとした，マスク着用者が普通な感じになったり，意識的に距離を保ったりということも普通になって，それに換気や，消毒などが，家庭内はどうしてもそういうリスクが高まりやすいだろうから，念入りになったりと，それと，ウイルス自体の進化がどういう都合なのか，そう少なくはないが，爆発的というほどでもなく，対応を助けていた面があるが，どういうわけか，そういう状況が，政治や財界や業者などには，安心開放のタイミングに捕らえられて，第三波も「 GO TOは因果関係なし」と言ってすませる．ちょっとしたカルトの蔓延という印象にならないだろうか．それでいて，ワクチンが，しかも，できるだけ効果が高くて安全性も高いワクチンに，もう安心というような期待をかける．そういうのも，いい加減ウンザリな気がする．首都圏の宣言解除も，感染者は増えるし，重症者や死者も増えると言っているのだから，それと引き換えの，開放花見気分だということくらい理解した上で，もの言って行けばいいのだろうが，どうせ，増えたら増えたなりに，アホ騒ぎするのだろうから，さもしい世論である．どんちゃん騒ぎしようが風俗行こうが，それ自体は人の勝手だが，どういうわけか，ウイルスもそういう場を好むから，その点は留意してね，ぐらいのことを，ヤク打たないと死ぬぐらいの勢いで言ってるわけだから，なんか，口と腹が裏腹のような反応もあって，わかりにくい．

Circuit(サーキット)は，回路だから，サーキット・ブレーカーは回路を遮断する装置ということだが，免疫応答のリレーを遮断したり，ウイルスの人獣巡回的な回路を遮断したり，あるいは，ウイルス感染の影響と，別な病気への影響や関連を明らかにしたりという,  (日本における変異株の動向が，当面，関心事であるのは当たり前にしても，)世界の関心事の根底に，当面の変異株の動向という狭い意味でのそれよりも根底的な懸念が生じていることへの言及がない感じがする．既存株についても，立遅れ気味に見える日本の対応が，変異株の動向を含むより根底的な対応にまで，とても間に合わないことが理由なのか，どっかでは，考えてみても良さそうである．こういうことを担当するのは，専門家や研究機関なわけだから，そんなことより経済が，なんてことにはならないのである．日本の経済てなんやねん，ということになるから．日本の行政や政治が，自由な経済活動を支えるコントロールを失って，もはや，企業犯罪詐欺組織の活動なのか，適格な企業活動なのか，区別もできないということになるから．地下経済活動の方が旺盛な，社会主義経済国家に実質しむけれれていることになるからである．犯罪国家の正当化が社会主義経済だ的なことがよく言われるが，そんなことは，社会主義でもなんでもないわけだから，少しイラっとくるが，わかりやすい話にはなるだろうということで．

変異系統というと，大正時代の先祖に，変異系統を生み出す力の強そうな先祖がいて，その子孫は，それぞれまた家族を作るわけだが，遠くなった親戚の子供がそっくりとか，大正時代の先祖にそっくりとか，そういうイメージでいいのだろうか．巷では，とりわけ，田舎ではよくそういう話を聞かされることがあるが，ウイルスの変異の系列にも通じそうな話である．なんらかの要因が優勢に働いて似た感じになるのか，そういう力の強そうな先祖の特性を強く受けついだのか，と決めかねる感じで，オヤジやおばん連中が話し込んでいる光景は，珍しくなかった．遺伝子学や分子生物学、生物進化などの科学として追求されているのだろうが，昔のおじんやおばん連中も巷話として楽しんでいたわけなのだろう．

Science誌掲載のreport, "The emerging plasticity of SARS-CoV-2"では，変異株，

D614G(Aps(アスパラギン酸) →Gly(グリシン))

N501T(Asn(アスパラギン)→Thr(トレオニン))

N501Y(Asn(アスパラギン) → Tyr(チロシン))

E484K(Glu(グルタミン酸) → Lys(リジン))

Q493K(Gln(グルタミン) → Lys(リジン))

K417N(Lys(リジン)→Asn(アスパラギン))

ここで，DとかNとかYとかは，AspとかAsnとかTyrとかのアミノ酸の一文字表記と言われるものである．最近，日本変異株E484Kが，ワクチンへの耐性があるらしいから，心配されているらしいニュースがあった．情報伝達系，シナプス系のような，前駆体としての促進-制御系というような，それぞれの役割が，どう働いているのかなど，細かい話は，専門的である気がする．基本的には，SARS-CoV-2は，まだ未解決の部分が残っているウイルスであって，人間側の思惑の強そうな政界評論家や政治家評論家のご都合とは関係ないということである．神奈川県知事も，政略的なデマの垂れ流し疑惑が発生しているようだが，そういう雰囲気(ぽい格好しい)で政治家の好みが生じる面もあるのだろう．それはそれ，ウイルスはウイルスである．一方で，バカでもチョンでも政治家は政治家という面もあるのだろう．厚生官僚もバカチョンなのか，流石に，気持ちが参りそうなのか，判断がハザードしたような報道もあったような．そういことに付け入るのも，政略だから．メディアも，そういう政略狙い的な面が強くなってる感じはする．コロナ対策アプリも中国ヤミ金スパイアプリじゃないのか的な疑念が生じるわけである．中国ヤミ金依存病院とかあるから，新型コロナ対策も進まないのではないかという疑念とか．二階系病院とか麻生系病院とか．大阪も維新ヤーチョンだらけで，まともな対策は打ちようがないという状況が全国に広まるとか．科学的知識はいい加減だが，政略家ぶりは恥を知らない政治家や評論家を重用する体質が，政財界やメディアにはあるのだろう．

 

新型コロナウィルス感染症を材料にして --- クローンウィルスをめぐって(9-2)

[SCIENCE ] science.abg6105.full

Neutralization of SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 pseudovirus by BNT162b2 vaccine-elicited human sera

ヒトの免疫力を引き出すBNT162b2ワクチンによる，SARS-CoV-2近縁B.1.1.7擬ウイルスの中和．

Recently, a new SARS-CoV-2 lineage called B.1.1.7(variant of concern:VOC 202012/01) emerged in the United Kingdom that was reported to spread more  efficiently and faster than other strains. This variant has an unusually large number of mutations with 10 amino acid changes in the spike protein, raising concerns that its recognition by neutrlizing antibodies may be affected. Here we tested SARS-CoV-2-S pseudoviruses bearing either the Wuhan reference strain or the B.1.1.7 lineage spike protein with sera of 40 perticipants who were vaccinated in previously  reported trial with the mRNA-based COVID-19 vaccine BNT162b2. The immune sera   had slightly reduced but overall largely preserved neutralizing titers against the B.1.1.7 lineage pseudovirus. These data indicate that B.1.1.7 lineage will not escape BNT162b2-mediated protection.

最近，イギリスで，他の株に比べてより拡散効率が高く，速度の早い，B.1.1.7と呼ばれるSARS-CoV-2 近縁株が出現した．この変異株は，スパイクタンパク質に10のアミノ酸の変化を持つ異常に大きな数の変異を持っており，中和抗体がそれを認識するかどうかに影響を及ぼすのかという心配を高めている．そこで，mRNAベースのCOVID-19ワクチンBNT162b2を以前の治験で摂取した40の参加者の血清を使って，武漢参照株とB.1.1.7近縁株スパイクタンパク質のどちらにSARS-CoV-2-S 擬ウイルスが類似するかを調べた．B.1.1.7近縁株擬ウイルスに対して，免疫血清はわずかに減ったが，総じて，中和度測定値はほとんど同じだった．これらのデータから，B.1.1.7近縁株はBNT162b2ワクチン接種による防御効果を逃れられないことが示される．

 

In a phase 3 trial conducted in the United States, Argentina, Brazil, South Africa, Germany, and Turkey, the BioNTech-Pfizer mRNA vaccine BNT162b2 was 95% effective in preventing COVID-19 through the data cut-off date of November 14, 2020 (1). The SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 was discovered to have emerged in the United Kingdom in September 2020 (2), and it subsequently increased in prevalence, showed enhanced transmissibility, and spread to other countries and continents (3). B.1.1.7 has a series of mutations in its spike (S) protein: ΔH69/V70, ΔY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, and D1118H. One of these mutations, N501Y, was of particular concern because it is located in the receptor binding site. The spike with this mutation binds more tightly to its celと各々関連するlular receptor, ACE-2 (4); and virus with this mutation has an increased host range that includes mice (5). BNT162b2-immune sera neutralized SARS-CoV-2 (USA/WA-1/2020 background strain) with an introduced N501Y mutation as efficiently as SARS-CoV-2 without the mutation (6). Further, 19 pseudoviruses, each bearing a SARS-CoV-2 S with a different mutation found in circulating virus strains, were also neutralized as efficiently as non-mutant SARS-CoV-2 S bearing pseudoviruses by BNT162b2-immune sera (7). The question remained whether a virus with the full set of mutations in the lineage B.1.1.7 spike each of which may potentially interfere with antibody binding would be neutralized efficiently by BNT162b2-immune sera.

合衆国，アルゼンチン，ブラジル，南アフリカ，ドイツ，トルコで実施された第3相治験において，BioNTech-Pfizer社のmRNAワクチン BNT162b2は，2020年11月14日を期限とするデータから，COVID-19の予防に95%の効果があった．2020年9月にイギリスで出現した，SARS-CoV-2近縁株B.1.1.7が発見され, その後，高い感染性を示して流行を拡大して，他の国や大陸に拡がっている．B.1.1.7は，そのスパイク(S)タンパク質に変異系列，ΔH69/V70, ΔY144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982AそしてD1118Hを持っている．これらの変異の1つ,  N501Yは，受容体結合領域に位置するという理由から，とりわけ懸念されている．この変異を持つスパイクは，細胞受容体ACE-2に,  よりきっちりと結合し，この変異を持つウイルスは，マウスを含めた宿主の範囲を拡大している．BNT162b2免疫血清は，その変異のないSARS-CoV-2へと同様の効果で，N501Y変異を導入したSARS-CoV-2(USA/WA-1/2020背景株)を中和した．感染を拡大するウイルス株に見出される異なる変異SARS-CoV-2と各々関連する19の擬ウイルスは,  BNT162b2免疫血清によって，擬ウイルスを生じる非変異SARS-CoV-2 Sへの効果と同様に中和された．残された疑問は，その各々が抗体の結合を妨げる可能性を持つ近縁株B.1.1.7スパイクの,  十分な組み合わせの変異株に，BNT162b2免疫血清が有効な中和を行うだろうかということである．

To answer this question, we generated VSV-SARS-CoV-2-S pseudoviruses bearing the Wuhan reference strain or the lineage B.1.1.7 spike protein (fig. S1). An unbiased set of sera of 40 participants in the previously reported German phase 1/2 trial (7), drawn from 26 younger (23-55 years) and 14 older adults (57-73 years) at 7 or 21 days after the booster immunization with 30 μg BNT162b2 (fig. S2), were tested for neutralization of SARS-CoV-2 Wuhan and lineage B.1.1.7 spike-pseudotyped VSV by a 50% neutralization assay (pVNT50). The 50% neutralization geometric mean titer (GMT) of the sera against the SARS-CoV-2 lineage B.1.1.7 spike-pseudotyped VSV for the younger adult group and the full analysis set were slightly, statistically significantly reduced compared to the GMTs against the Wuhan reference spike-pseudotyped VSV (Fig. 1 and table S1). GMTs were not significantly different for the older adult group. The calculated geometric mean ratio with 95% confidence interval of the B.1.1.7 pseudotype and the Wuhan pseudotype GMTs was 0.78 [0.68;0.89] for the younger and 0.83 [0.65;1.1] for the older adults (0.80 [0.71;0.89] in aggregate) (Fig. 2). No statistical difference in the ratio was observed in between the younger and the older vaccinated participants.

この疑問に答えるために，武漢参照株あるいは近縁株B.1.1.7スパイクタンパク質に関連するVSV-SARS-CoV-2-S 擬ウイルスを作り出した．50%中和検査(pVNT50)によって，ドイツの第1/2相治験で以前報告された，７日あるいは21日後に30μgのBNT162b2を接種して免疫を補強した，23-55歳の成人26人および57-73歳の成人14人を抽出して，40人の治験参加者の偏りのないひと組の血清の，SARS-CoV-2武漢株および近縁株B.1.1.7スパイク擬型VSVへの中和度がテストされた．若い方の成人グループに対するSARS-CoV-2近縁株B.1.1.7スパイク擬型VSVに対する血清の50%中和幾何平均滴定(GMT)および全分析集合には，武漢参照株スパイク擬型VSVに対するGMTと比較して，わずかだが，統計的には明らかな減少が見られた．GMTは，より年配の成人グループでは，顕著な差はなかった．B.1.1.7擬型および武漢擬型GMTの95%信頼区間での幾何平均比が計算され，若い方の成人で0.78[0.68 ; 0.89],  年配成人グループで0.83[0.61 ; 1.1] (全体として，0.80 [0.71; 0.89])であった．ワクチン接種参加者の若年成人と年配成人の間に，その比率に統計的な差は見られなかった．

Based on experience from studying antibody correlates of disease protection for influenza virus vaccines, a 20% reduced titer does not indicate a biologically significant change in neutralization activity (8, 9). The largely preserved neutralization of pseudoviruses bearing the B.1.1.7 spike by BNT162b2-immune sera makes it unlikely that the UK variant virus will escape BNT162b2-mediated protection.

インフルエンザウイルスワクチンでの，病気を防ぐことに関連する抗体の研究の経験に基づいて，20%削減滴定値は, 中和活性において，生物学的に顕著な変化は示されなかった．B.1.1.7スパイク関連擬ウイルスへの大きく保存されたBNT162b2免疫血清による中和性は，UK変異ウイルスが，BNT162b2が成立させる防疫から逃れることを防いでいる．

A potential limitation of the work may be the use of a non-replicating pseudovirus system. However, previous reports have shown good concordance between pseudotype neutralization and SARS-CoV-2 neutralization assays (10, 11). Still, concordance may vary looking at different SARS-CoV-2 strains and remains to be demonstrated in case of the SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage. Additional experiments will confirm efficient neutralization of B.1.1.7 lineage clinical isolates. This study has evaluated sera elicited by the recommended regimen of two doses administered 21 days apart and does not provide insight into neutralization if the recommended dosing regimen is not followed. The ongoing evolution of SARS-CoV-2 necessitates continuous monitoring of the significance of changes for maintained protection by the currently authorized vaccines. Unlike the protocol for influenza vaccines, the degree of reduction in neutralization that might indicate a need for a strain change has not yet been established for COVID-19 vaccines. A previous study demonstrated that BNT162b2 elicits both a polyepitopic CD8+ T cell response to the encoded spike protein and virus neutralizing antibodies (7). Given the multiple potential mediators of protection elicited by BNT162b2, it is possible that vaccine efficacy could be preserved in the longer term, even with substantial losses of neutralization by vaccine-elicited sera. This view is further supported by the rapid onset of disease protection about 12 days after the first dose of BNT162b2 at a time when neutralizing antibody titers are still very low (1). Absent an established correlate of protection, clinical effectiveness data will be needed to provide definitive assessment of vaccine-mediated protection against viral variants. 

複製のない擬ウイルス系を使うことによる研究の制限があるかもしれないが，以前のレポートで，擬型中和能とSARS-CoV-2中和能の検査の間に良い一致が見られた．さらに，この一致は，異なるSARS-CoV-2株で変わった姿をとるかもしれないし，SARS-CoV-2 B.1.1.7近縁株の場合でも証明されるかもしれない．もっと実験が進めば，臨床的に特定されるB.1.1.7近縁株への有効な中和能を確認できるだろう．この研究は，21日間の２つの別な投薬治療の推奨により生じる血清を評価したものであって，推奨投薬治療が続けられなかった場合の中和能を調べるものではない．SARS-CoV-2の進行する変異には，現在認可されているワクチンの持続的効果の顕著な変化を継続的に監視する必要がある．インフルエンザワクチンのプロトコールとは違って，株の変化に対して必要となる，中和能の減少の度合いは，COVID-19ワクチンに対しては，まだ，定まっていない．以前の研究で，BNT162b2は，コードされたスパイクタンパク質への多抗原性CD8陽性T細胞反応とウイルス中和抗体の双方を誘発することが示された．BNT162b2によって誘発される, 多様な能力を持った媒介因子を与えるならば，ワクチンで誘発される血清による中和能のかなりの損失があったとしても，ワクチンの効果は長期間保存されるだろう．この見解は、中和抗体の値がまだ非常に低い時点での，BNT162b2の最初の投薬のおよそ12日後の迅速な防疫の開始によって，さらに支持される．防疫に関する定まった相関が欠如しているので，臨床的な有効性を示すデータのためには，ウイルス変異株に対するワクチンの防疫力のはっきりとした評価法を与えることが必要である．

Although sustained neutralization of the current B.1.1.7 variant is reassuring, preparation for potential COVID-19 vaccine strain change is prudent. Adaptation of the vaccine to a new virus strain would be facilitated by the flexibility of mRNA-based vaccine technology.

現在のB.1.1.7変異株への中和能が維持されていることは，安心材料ではあるが，COVID-19ワクチンの有効性の変化をもたらす株への備えは，賢明なことである．新たなウイルス株へワクチンを適合させることは，mRNAベースのワクチン・テクノロジーの柔軟性によって円滑化されるだろう．

 [SCIENCE ] science.abf6950(2021)

Recurrent deletions in the SARS-CoV-2 spike glycoprotein drive antibody escape

SARS-COV-2 スパイク糖タンパク質における繰り返される欠失は，抗体逃避に向かわせる．

Abstract

Zoonotic pandemics, like that caused by SARS-CoV-2, can follow the spillover of animal viruses into highly susceptible human populations. Their descendants have adapted to the human host and evolved to evade immune pressure. Coronaviruses acquire substitutions more slowly than other RNA viruses, due to a proofreading polymerase. In the spike glycoprotein, we find recurrent deletions overcome this slow substitution rate. Deletion variants arise in diverse genetic and geographic backgrounds, transmit efficiently, and are present in novel lineages, including those of current global concern. They frequently occupy recurrent deletion regions (RDRs), which map to defined antibody epitopes. Deletions in RDRs confer resistance to neutralizing antibodies. By altering stretches of amino acids, deletions appear to accelerate SARS-CoV-2 antigenic evolution and may, more generally, drive adaptive evolution.

[概要] SARS-CoV-2によって引き起こされる様な，人獣共通感染症パンデミックは，動物ウイルスから，高い感染感受性を持つヒト集団への波及から生じる．それらの子孫株はヒト宿主に順応して，免疫圧力から逃れる様に進化する．コロナウイルスは，校正機能を果たすポリメラーゼ(転写酵素)のために，他のRNAよりもゆっくりと遺伝子が置換されるが，我々は，スパイク糖タンパク質において，この低い置換率より，反復される欠失が優っていることを発見した．欠失変異は，様々な遺伝子的および地理的背景, 伝染効率において生じ，現在世界中が懸念している株を含む，新たに生じた系統株に存在している．それらは，頻繁に，反復欠失領域(RDRs)を占有して，明らかになっている抗体に対するエピトープ(抗原決定基)の地図を作っている．RDRsにおける欠失は，中和抗体に対する耐性を与える．アミノ酸の選択的引き伸ばしによって，欠失は，SARS-CoV-2抗原の変異を加速させ，より一般的に言えば，順応した変異が促される．

 

SARS-CoV-2 emerged from a yet-to-be defined animal reservoir and initiated a pandemic in 2020 (1–5). It has acquired limited adaptions, most notably the D614G substitution in the spike (S) glycoprotein (6–8). Humoral immunity to S glycoprotein appears to be the strongest correlate of protection (9) and recently approved vaccines deliver this antigen by immunization. Coronaviruses like SARS-CoV-2 slowly acquire substitutions due to a proofreading RNA dependent RNA polymerase (RdRp) (10, 11). Other emerging respiratory viruses have produced pandemics followed by endemic human-to-human spread. The latter is often contingent upon the introduction of antigenic novelty that enables reinfection of previously immune individuals. Whether SARS-CoV-2 S glycoprotein will evolve altered antigenicity, or specifically how it may change in response to immune pressure, remains unknown. We and others have reported the acquisition of deletions in the amino (N)-terminal domain (NTD) of the S glycoprotein during long-term infections of often-immunocompromised patients (12–15). We have identified this as an evolutionary pattern defined by recurrent deletions that alter defined antibody epitopes. Unlike substitutions, deletions cannot be corrected by proofreading activity and this may accelerate adaptive evolution in SARS-CoV-2.

SARS-CoV-2は，まだはっきりとはしていないが，ウイルスを保有している動物から発生し，2020年にパンデミックとなった．スパイク(S)糖タンパク質における，特にD614G置換株が限定的な順応を得ていた．S 糖タンパク質への液性免疫は，防疫に最も強く関与するものとみられている．SARS-CoV-2の様なコロナウイルスは，校正機能を果たすRAN依存性RANポリメラーゼ(RdRp)のために，置換変異がゆっくりとしている．他の，呼吸器症状を引き起こすウイルスは，風土病的にヒト-ヒト感染が広がることで，パンデミックを引き起こしてきた．それは，しばしば，以前に免疫を獲得した個体に二次感染を起こせる，新たな抗原性の導入があるかどうかにかかっている．SARS-CoV-2 S 糖タンパク質は，選択的に抗原性を進化させるのかどうか，あるいは，特に，免疫圧力に反応して，どの様に変わるのかは，分かっていない．しばしば免疫障害を起こす患者の長く続く感染の間に，S 糖タンパク質のアミノ(N)末端領域(NTD)における欠失変異が生じていることが，我々や他からも，報告されている．我々は，このことを，明らかに抗体(逃避)のために抗原が変化する，反復欠失によって決まる変異パターンであると認識した．置換変異とは違って，欠失変異は，校正機能の活性によって訂正されない．そしてこのことから，SARS-CoV-2における順応変異が加速されるかもしれない．

An immunocompromised cancer patient infected with SARS-CoV-2 was unable to clear the virus and succumbed to the infection 74 days after COVID-19 diagnosis (15). Treatment included Remdesivir, dexamethasone and two infusions of convalescent serum. We designate the individual as Pittsburgh long-term infection 1 (PLTI1). We consensus sequenced and cloned S genes directly from clinical material obtained 72 days following COVID-19 diagnosis and identified two variants with deletions in the NTD (Fig. 1A).

 SARS-CoV-2に感染した免疫障害がん患者は，ウイルスを消し去ることができず，COVID-19の診断後74日感染したままであった．レムデシベル，デキサメタゾン, および, 回復期の人の血清の2種の点滴投与を含む治療がなされた．その症例を，ピッツバーグ長期感染1(PLTI1)と名付けた．COVID-19診断以降の72日間で得られた臨床的情報から直接的に，コンセンサス配列とクローン S 遺伝子を調べて， NTDに欠失を持つ2つの変異を確認した．

These data from PLTI1 and a similar report (12) prompted us to interrogate patient metadata sequences deposited in GISAID (16). In searching for similar viruses, we identified eight patients with deletions in the S glycoproteins of viruses sampled longitudinally over a period of weeks to months (Fig. 1A and fig. S1A). For each, early time points had intact S sequences and later time points had deletions within the S gene. Six had deletions that were identical to, overlapping with, or adjacent to those in PLTI1. Deletions at a second site were present in viruses isolated from two other patients (Fig. 1B), reports on these patients have since been published (13, 14). Viruses from all but one patient could be distinguished from one another by nucleotide differences present at both early and late time points (fig. S1B). On a tree of representative contemporaneously circulating isolates they form monophyletic clades making either a second community- or nosocomially-acquired infection unlikely (fig. S1C). The most parsimonious explanation is these deletions arose independently due to a common selective pressure to produce strikingly convergent outcomes.

PLTI1から得られたデータおよび同様な報告に促されて，GISAIDに保管されている患者のメタデータの一連の結果を調べた．同様なウイルスを調べて，数週間から数カ月の長期にわたって抽出された，ウイルスのSタンパク質に欠失を持つ8人の患者を確認した．各々，早い時期では，S配列に変化はなかったが，時間を経た時点では，S遺伝子に欠失が生じていた．6例で，PLTI1におけるものに同じ，あるいは重複する，あるいは近い場所における欠失が生じていた．第二の(別の)地点での欠失は，別な二人の患者から分離されたウイルスに存在した．これらの患者に関するレポートは，今は出版されている．一人を除く全ての患者からのウイルスは，初期および後期双方の時点で存在するヌクレオチドの違いによって，互いに区別できた．同時的な環状代表を単離した樹形図において，それらが，感染の別な群，あるいは，起こりそうではないが，院内感染のどちらかを作る，単系クレードを形作る．最も控えめな説明は，これらの欠失が，明らかな一つの結果を産む様に，共通する選択的圧力により独立に生じたというものである．

We searched the GISAID sequence database (16) for additional instances of deletions within S glycoproteins. From a dataset of 146,795 sequences (deposited from 12/01/2019 to 10/24/2020) we identified 1,108 viruses with deletions in the S gene. When mapped to the S gene, 90% occupied four discrete sites within the NTD (Fig. 2A). We term these important sites recurrent deletion regions (RDRs), numbering them 1-4 from the 5′ to 3′ end of the S gene. Deletions identified in patient samples correspond to RDR2 (Fig. 1A) and RDR4 (Fig. 1B). Most deletions appear to have arisen and been retained in replication competent viruses. Without selective pressure, in-frame deletions should occur one third of the time. However, we observed a preponderance of in-frame deletions with lengths of 3, 6, 9 and 12 (Fig. 2B). Among all deletions, 93% are in frame and do not produce a stop codon (Fig. 2C). In the NTD, >97% of deletions maintain the open reading frame. Other S glycoprotein domains do not follow this trend e.g., deletions in the receptor binding domain (RBD) and S2 preserve the reading frame 30% and 37% of the time, respectively.

 我々は，S糖タンパク質のなかの欠失の付加的な例を，GISAIDシーケンスデータベースの中に探した．(12/01/2019から10/24/2020の間に登録された)146,795シーケンスのデータセットから，S遺伝子に欠失を持つ1,108のウイルスを確認した．S遺伝子を地図にすると、90%が，NTDの中にある4つの別々な場所を占めていた．これらの重要な場所を，反復欠失領域(RDRs)と呼ぶことにした．S遺伝子の5’末端から 3’末端に向けて，それらに1-4の番号を割り振った．欠失は，患者の例では，RDR2およびRDR4に対応する場所に認められた．ほとんどの欠失は，複製能力を持つウイルスにおいて生じ，定着していた．選択的圧力なしに，読み枠内の欠失は，その回の1/3を生じるはずであるが，3,6, 9および12の長さを持つ読み枠内の欠失が多いことを観察した．ほとんどすべての欠失の中で，93%は，読み枠内であり，終止コドンを作らない．NTDにおいて，欠失の>97%は，オープンリーディングフレームを維持する．別なS 糖タンパク質領域は，この傾向に従わない．例えば，受容体結合領域(RBD)およびS2における欠失は，それぞれ，読み枠の30%およびその回の37%を維持する．

To trace the origins of RDR variants, we produced phylogenies for each with 101 additional genomes that sample much of the genetic diversity within the pandemic (Fig. 2D). The RDR variants interleave with non-deletion sequences and occupy distinct branches, indicating their recurrent generation. This is most pronounced for RDRs 1, 2 and 4 but also true of RDR 3, with conservatively four independent instances. RDR variants form distinct lineages/branches, most prominently in RDR1 (lineage B.1.258) and suggest human-to-human transmission events. We verified, using sequences with sufficient metadata that explicitly differentiate individuals, the transmission of a variant within each RDR between people (fig. S2).

RDR変異の起源を追跡するために，パンデミックにおける遺伝子的な多様性のほとんどの例に当たる，101の付加的なゲノムを持つ各々に対する系統(図)を作った．RDR変異は非欠失配列に差し込まれ，反復の世代を示す，互いに区別される分枝を占める．このことは，RDR 3に対しても言えるのだが，慎重に4つの独立した例を使って，RDRs1,2 および4に対して最もよく確認できる．RDR変異は，RDR1(系統 B.1.258)において最も顕著であり，ヒト- ヒト感染イベントを示す，異なる系統/分岐を形作る．我々は，十分なメタデータを伴うシーケンスを使って，明確に個体を区別し，人々の間で各RDRにおける変異の伝達を確かめた．

We defined the RDRs based upon peaks in the spectrum of S glycoprotein deletions. Deletion lengths and positions vary within RDRs 1, 2 and 4 (Fig. 2E). Variation is greatest in RDRs 2 and 4 with the loss of S glycoprotein residues 144/145 (adjacent tyrosine codons) in RDR2 and 243-244 in RDR4 appearing to be favored. In contrast, the loss of residues 69-70 accounts for the vast majority of RDR1 deletions. Based upon our phylogenetic analysis and supported by accompanying lineage classifications this two amino acid deletion has arisen independently at least thirteen times. RDR3 largely consists of three nucleotide (nt) deletions in codon 220.

S 糖タンパク質欠失の変動範囲におけるピークに基づいて，RDRsを定めた．欠失の長さや位置は，RDRs 1, 2 および 4 において異なる．変化は，RDR2において，S 糖タンパク質残基144/145(隣接チロシン・コドン)の消失，好まれる傾向がある様に見える，RDR 4 における243-244の消失を持つ，RDRs 2 および 4 において最も大きい．対照的に，RDR 1の欠失の大多数に対しては，69 - 70の残基の消失が数えられる．我々の系統分析に基づき，系統分類がなされることで支持される，この2つのアミノ酸欠失は，少なくとも1３回独立に生じていた. RDR3は，主に，コドン 220 における3つのヌクレオチド(nt)欠失からできている．

We evaluated the genetic, geographic and temporal sampling of RDR variants (Fig. 3, A and B). This analysis is limited to sequences deposited in GISAID (16) where sequences from specific nations and regions are overrepresented e.g., United Kingdom and other European countries. We show the distribution of all sequences within the database for reference. For RDRs 2 and 4 the genetic and geographic distributions largely mirror those of reported sequences. Variants of RDRs 1 and 3 are strongly polarized to specific clades and geographies. This is likely the result of successful lineages, circulating in regions with strong sequencing initiatives. Our temporal analysis indicates that RDR variants have been present throughout the pandemic (Fig. 3C). Specific variant lineages like B.1.258 (Fig. 2D) harboring Δ69-70 in RDR1 have rapidly risen to notable abundance (Fig. 3D). Circulation of B.1.36 with RDR3 Δ210 accounts for most of the RDR3 examples (Figs. 2D and Fig. 3, C and D). The abundance of RDR2 Δ144/145 is explained by independent deletion events followed by transmission (Fig. 2D and Fig. 3, C and D).

 われわれの分析は，特定の国や地域，例えば，イギリスや他の欧州諸国からの配列が標本代表として過剰になっている，GISAIDに登録されている配列に限られているが，RDRの遺伝子的，位置的，時間的な標本を評価し，参照したデータベースの範囲内のすべての配列の分布を示す．RDRs 2や4に対しては，遺伝子的，位置的な分布は，報告されている(遺伝子)配列のそれを大いに反映している．RDRs1および3の変異は，特定のクレードや位置に際立って分極される．これは，強く配列化を先導する領域において，うまくいった系列化や環状化の結果であると言えそうである．時間的な分析で，RDR変異は，パンデミックの間に現れたことが示された．RDR1にΔ69-70を停泊させるB.1.258の様な特定の系統変異は，目立って豊富になるように，迅速に増加する．RDR3 Δ210を持つB.1.36の循環は，RDR3見本のほとんで認められる．RDR2 Δ144/145が豊富であるのは，伝染にひき続いて独立な欠失が生じることで説明される．

The recurrence and convergence of RDR deletions, particularly during long-term infections, is indicative of adaptation in response to a common selective pressure. RDRs 2 and 4 and RDRs 1 and 3 occupy two distinct surfaces on the S glycoprotein NTD (Fig. 4A). Both sites contain antibody epitopes (17–19). The epitope for neutralizing antibody 4A8 is formed entirely by the beta sheets and extended connecting loops that harbor RDRs 2 and 4 (17). We generated a panel of S glycoprotein mutants representing the four RDRs to assess the impact deletions have on expression and antibody binding, we included an additional double mutant containing the deletions present in the B.1.1.7 variant of concern flagged initially in the United Kingdom. Cells were transfected with plasmids expressing these mutant glycoproteins and indirect immunofluorescence was used to determine if RDR deletions modulated 4A8 binding (Fig. 4B). Deletions at RDRs 1 and 3 had no impact on the binding of the monoclonal antibody, confirming that they alter independent sites. The three RDR2 deletions, the one RDR4 deletion and the double RDR1/2 deletions completely abolished binding of 4A8 while still allowing recognition by a monoclonal antibody targeting the RBD (Fig. 4B). Thus, convergent evolution operates in individual RDRs and between RDRs, exemplified by the same phenotype produced by deletions in RDR2 or RDR4.

 特に長期にわたる感染の間のRDR欠失変異の反復や集中は，共通の選択的圧力への反応に順応していることを示している．RDRs2および4またRDRs1および3は，S 糖タンパク質NTDの2つの異なる表面を占めている．双方の地点には，抗体エピトープが含まれている．中和抗体4A8に対するエピトープは，RDRs2および4を繫ぎ止める，ベータシートと延長結合ループによって，完全に形成されている．われわれは，表現発現と抗体の結合に大きな影響を持つ様にするために，4つのRDRsを代表するS 糖タンパク質の変異のパネルを作成して，イギリスで最初に確認され関心事となったB.1.1.7変異株に存在する欠失にさらに欠失の加わった変異株を含めて調べた．これらの変異糖タンパク質と間接的な免疫蛍光を表すプラスミドで細胞をトランスフェクトして，RDR欠失が，4A8結合を調節するかどうかを決定するために使った．RDRs1および3での欠失は，モノクローナル抗体の結合に影響せず，それらは，独立した地点を選択することが確かめられた．3つのRDR2欠失，1つのRDR4欠失および２重のRDR1/2欠失は，RBDを標的とするモノクローナル抗体がまだ認識できる間，4A8の結合を完全に消失させていた．したがって，個別のRDRsおよびRDRs間で集中的進化が行われ，RDR2あるいはRDR4における欠失によって産生される同じ表現型によって例化される．

We assayed whether RDR variants escape the activity of a neutralizing antibody using the non-plaque purified viral population from PLTI1. This viral stock was completely resistant to neutralization by 4A8, while an isolate with authentic RDRs (20) was neutralized (Fig. 4C). We used a high titer neutralizing human convalescent polyclonal antiserum to demonstrate that both viral stocks could be neutralized efficiently. These data demonstrate that naturally arising and circulating variants of SARS-CoV-2 have altered antigenicity. We used a range of high, medium and low titer neutralizing human convalescent polyclonal antisera to assess if there was an appreciable difference in neutralization between the S glycoprotein-deleted and undeleted viruses. No major difference was observed suggesting that many more changes would be required to generate serologically distinct SARS-CoV-2 variants (table S1).

 PLTI1から非プラーク精製されたウイルス集団を使って，RDR変異が中和抗体の働きから逃れられるかどうかを調べた．このウイルスストックは，本来のRDRと切り離されたものが中和されるに対して，4A8による中和に完全に耐性を持っていた．双方のウイルスストックが効果的に中和されることを説明するために，高い中和測定値のヒト回復期ポリクロナール抗血清を使った．これらのデータから，SARS-CoV-2の自然な発生と波及は，抗原性を変化させることを明らかにする．S 糖タンパク質欠失と非欠失ウイルスの間で，中和にはっきりとした違いがあるかどうかを調べるために，高い，中位の，低い中和測定値のヒト回復期ポリクローナル抗血清を使った．多くのさらなる変化において，血清学的に異なるSARS-CoV-2変異を作り出すために必要なことが示される，大きな違いは観察されなかった．

Coronaviruses, including SARS-CoV-2, have lower substitution rates than other RNA viruses due to an RdRp with proofreading activity (10, 11). However, proofreading cannot correct deletions. We find that adaptive evolution of S glycoprotein is augmented by a tolerance for deletions, particularly within RDRs. The RDRs occupy defined antibody epitopes within the NTD (17–19) and deletions at multiple sites confer resistance to a neutralizing antibody. Deletions represent a generalizable mechanism through which S glycoprotein rapidly acquires genetic and antigenic novelty of SARS-CoV-2. 

SARS-CoV-2を含めたコロナウイルスは，校正を行う働きを持つRdRpのために，他のRNAウイルスより置換変異率が低いが，校正は，欠失を正すことはできない．われわれは，S 糖タンパク質の順応進化は，特にRDRsにおいて，欠失に対して寛容な面があることを発見した．RDRsは，NTDにおける定まった抗体エピトープ，および，中和抗体への耐性に関わる複数の地点での欠失を持っている．欠失は，S 糖タンパク質が，SARS-CoV-2の遺伝子および抗原的な新種を急速に獲得することを通じた，一般的な機構である．