今日、放送大学の生物情報学実習で習ってきたことを、復習してみる
（理解が間違っているところもあるかも・・）
DNAの並び方（シーケンス）は、
アメリカの場合、NCBI(GenBank)、
日本はDDBJ
ヨーロッパはEMBL
でデータベース化されている。
このシーケンスは、どーやって決めるか？という話。
最近は、Pyrosequence法などもあるらしいけど、今回は、サンガー法について。
この方法は、まず、調べようとするDNAを１本鎖にします。
で、そーすると、反対側のDNAを合成するわけですが、このとき、
・DNA合成酵素である、dATP,dGTP,dCTP,dTTPを一杯入れておきます。
→dはデオキシ、dNTPのNがA,G,C,T(アデニン、グアニン、シトシン、チミン）
・さらに、もうひとつ酸素をとった（デオキシ）ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTPも
一杯入れておきます→これをまとめて、ddNTPと書きます。
そうすると、dNTP（DNA合成酵素）が来ている間は合成をしていますが、ddNTPがくると、そこで、合成はとまります。(ddNTPがあると、酸素が取れているので結合できない）。
たとえば、３００塩基の一本鎖がたくさんあったとすると、
・１番目のみがdNTPで２番目がddNTPで、２番目で止まる
・２番目までがdNTPで３番目がddNTPで、３番目で止まる
・３番目までがdNTPで４番目がddNTPで、４番目で止まる
：
とか、いろんなところでとまるものができる。（極論すれば、無限にあり、ランダムに止まるとすると、１塩基でとまるものから、３００塩基で止まるものまですべてのものがあるはず）。
そして、最後のddNTPは、そのとまったところに対応する、DNAの塩基対（ATCP)に対応しているはずである。で、ここで、ddNTPは蛍光塗料でマークしておく。なので、１番目にとまったものの、止まった箇所のddNTPは、１番目のDNA塩基対に対応しているし、２番目の・・・
ってなかんじで、ddNTPは、そこのDNAに対応していて、１番目から３００番目まで、すべての箇所のddNTPのものがあるはずである。
さてここで、上記の「いろんなところでとまった」ものを、電気泳動する。
そーすると、短いものから、長いものまで、順番に並ぶ。
ってことは、
１番目でとまったもの、２番目でとまったもの、３番目でとまったもの・・・３００番目でとまったものというようにわかれる。
このとき、１番目でとまったものは、上記のことにより、１番目のDNAに対応したddNTPで終わっていて（ってことは１番目のDNAの塩基は同じだから、１番目のところはみんな同じddNTPでおわっているはずだ。理論上）、そのddNTPのNが、AかTかCかGかは、ddNTPに蛍光塗料をぬっておいてあるので、その蛍光塗料の量で、どのddNTPが多いかでわかるはずだ。。
ということで、それぞれの電気泳動でとまったところの、ｄｄNTPの量を出してくれば良い。そのところのddNTPの量がおおいのが、そこに対応する塩基対。
ここまでの処理を行うのがDNAシーケンサー
で、そのｄｄNTPの量から、DNAのシーケンスを決めるソフト（っていうか、画面でみれる）ソフトが、Chromas（シェアウエアのソフトって書いてある）
で、これで、１本分がきまった・・・
けど、実際には、こーいう塩基配列は、部分部分にきれているので、つなぎ合わせないといけない。この部分部分の塩基配列をつなぎ合わせるソフトが、bioedit（フリーソフト：ChromasみたいなddNTPの各量を表示したりする機能もある）。
今回の実習は、abiファイルとかいうのができていて（上記のChromasなんかでも使う各量を波で表示するグラフ）、それを、
１．１本目は、File→Openで、
２本目からは、File→Inport→Sequence alignment fileで読み込む
２．シーケンスが出てきたら、Back Colored View Modeというのにすると、
AGCT別々の色になるので見やすい。
このモードにするには、シーケンスが並んでいるところの、TCAGとかが４列になっている
アイコンのうち、全部背景に色が塗ってあるものをクリックする（ごめん、わかりにくい
説明で。いちばん左の南京錠からかぞえて、１１番目。ちなみに、１０番目はすでにON
になっている）
３．左端のラベル？（シーケンスが始まる前の部分）を２つ選択。
１つめはクリックでOK。２つめは、コントロールキーをおして、クリック
４．これから、どこが一致するか探す。
まず、Sequence→Dot plotを選択。ダイアログは、OKで答えていくと、
線がひかれた図がでてくる。
もし、一致していれば、斜め下とかにむかって、大きく線が出る。それが一致面。
そこの一番上のほうをクリックすると、上に座標が出る。X軸がその一致開始点
（＝つながるところ）
５．シーケンスにもどって、シーケンスの上のいっぱいアイコンが並んでいるところに、
G/Dと書いてあるところがある（南京錠から数えて７つめ）ので、ここをクリックし、
２本目をドラッグすると動くから、４のつながるところまで持っていく。
６．できたら、南京錠をクリックすると、はずすまでプロテクトされる。
File→Save Asで保存できる。
なお、１本が３プライムから５プライムにしているのに、もう一本が５プライムから３プライムへと、逆方向にしてしまうと、当然一致しない。
この場合は、Sequence→Nucleic Acid→Reverse Complementを選ぶと、方向が逆になる。
この、シーケンスを一致させるのを、自動的にやるソフト（contig assembly program）がある。
CAPっていうやつで、起動すると、自動的に適当？にやってくれる。
bioeditの中に入っているのかな？
今回はここまで。
次回はタンパク質のグラフィック表示 RasMol（フリーソフト）について
（本当は今日、ちょとやったけど、中途半端なのと、ここできりがいいので、
今回はここまで）
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