癌治療としてのビタミンCは、これまで論争の的となってきた。この論争の多くは、患者を層別化するための予測バイオマーカーがないことと、抗がん作用の基盤となる作用機序とその複数の標的に関する明確な理解がないことに起因している。以下は最近の文献
New potential biomarker for stratification of patients for pharmacological vitamin C in adjuvant settings of cancer therapy
要旨
この図は、ミトコンドリア呼吸の障害によるアスコルビン酸フリーラジカル（AFR）の細胞毒性、および膜結合型NADH：チトクロームb5酸化還元酵素3（Cyb5R3）による哺乳類の除去機構を示すいくつかの事実に基づいて、高用量ビタミンCの癌脆弱性に関する分析を拡大したものである。我々は、ビタミンCが、細胞内のAFRの定常濃度や、癌細胞と正常細胞におけるCyb5R3の発現/活性の違いによって、細胞の恒常性に影響を与える「保護モード」または「破壊モード」で機能することを提案する。したがって、ビタミンC療法の高用量で特異的な抗がん作用を得ることができる。本総説は、学生からこの分野の専門家まで、幅広い読者を対象としている。
キーワード アスコルビン酸フリーラジカル、がん、ミトコンドリア、NADH:シトクロムb5酸化還元酵素3、レドックスシグナリング。
薬学雑誌 122 (10), 831-839, 2002-10-01
公益社団法人 日本薬学会
The diabetogenic action of alloxan is thought to be initiated by generation of reactive oxygen species (ROS). Ascorbate can be an antioxidant in a predominantly aqueous environment, such as plasma and extracellular fluids. We have investigated the generation of ROS in the interaction of alloxan with ascorbate. Rapid oxygen consumption was observed in the reaction system of alloxan with ascorbate. The oxygen consumption was suppressed by superoxide dismutase and catalase, suggesting that superoxide and hydrogen peroxide could be generated in the reaction system. In addition, the generation of alloxan radical, an electron reductance of alloxan, and ascorbate free radical (AFR), an electron oxidant of ascorbate, was observed using electron spin resonance (ESR). Under anaerobic conditions, the ESR signal intensity of alloxan radical was significantly increased in comparison with that under aerobic conditions, whereas the intensity of AFR was significantly decreased. These results suggest that alloxan radical and AFR were generated in the reaction system of alloxan with ascorbate, and that the alloxan radical but not AFR reacted with molecular oxygen, resulting in the generation of ROS.
アロキサンは毒性をもつグルコース類縁体である。齧歯動物や他の動物に投与すると膵臓のインスリン合成細胞（β細胞）を選択的に破壊する。これはヒトの1型糖尿病に特徴が似ており、これらの動物でインスリン依存型糖尿病（いわゆるアロキサン糖尿病）が引き起こされている。アロキサンがGLUT2グルコース輸送体によってβ細胞に選択的に蓄積されるのが原因である。アロキサンは細胞内のチオールの存在により、その還元体であるジアルル酸との間でサイクル反応を起こし、活性酸素種(ROS)を生成する。アロキサンのβ細胞毒性作用は酸化還元反応によって生成したフリーラジカルによって始められる[3]。
Abstract
Our graphical review expands the analysis of cancer vulnerabilities for high dose vitamin C, based on several facts, illustrating the cytotoxic potential of the ascorbate free radical (AFR) via impairment of mitochondrial respiration and the mechanisms of its elimination in mammals by the membrane-bound NADH:cytochrome b5 oxidoreductase 3 (Cyb5R3). We propose that vitamin C can function in "protective mode" or "destructive mode" affecting cellular homeostasis, depending on the intracellular "steady-state" concentration of AFR and differential expression/activity of Cyb5R3 in cancerous and normal cells. Thus, a specific anti-cancer effect can be achieved at high doses of vitamin C therapy. The review is intended for a wide audience of readers - from students to specialists in the field.
Keywords: Ascorbate free radical; Cancer; Mitochondria; NADH:Cytochrome b5 oxidoreductase 3; Redox signaling.
Copyright © 2019 The Authors. Published by Elsevier B.V. All rights reserved.
Vitamin C physiology: the known and the unknown and Goldilocks
Sebastian J Padayatty, FFARCS, MRCP, PhD and Mark Levine, MD
ビタミンCの生理学：既知と未知、そしてゴルディロックス
Sebastian J Padayatty, FFARCS, MRCP, PhD and Mark Levine, MD
追加記事情報
要旨
抗壊血病性ビタミンであるビタミンC（アスコルビン酸）は、ヒトや他の霊長類では合成することができず、食事から摂取することが必要である。アスコルビン酸は電子供与体であり、15種類の哺乳類酵素の補酵素として働いている。アスコルビン酸には2種類のナトリウム依存性トランスポーターが存在し、その酸化生成物であるデヒドロアスコルビン酸はグルコーストランスポーターにより輸送される。アスコルビン酸は、ほとんどの組織や体液に差動的に蓄積されます。血漿および組織中のビタミンC濃度は、消費量、バイオアベイラビリティ、腎排泄、利用率に依存する。生物学的に意味のある、あるいは臨床的に適切なビタミンCの作用に関するin vitroおよびin vivo研究は、ビタミンの生理的濃度を考慮に入れなければならない。この論文では、ビタミンCの生理学、新しい知見が得られている、あるいは理解がまだ不十分なビタミンCに関わる多くの現象、ビタミンに関する疑問、そして有益と思われる研究の方向性について概説している。
キーワード ビタミンC、デヒドロアスコルビン酸、ビタミンC輸送、壊血病、用量濃度関係、推奨食事許容量
はじめに
ビタミンC（アスコルビン酸、AAと略す、ビタミンCとアスコルビン酸の用語は互換的に用いられる）は、すべての植物とほとんどの動物で合成される（Smirnoffら、2001年）。AA合成経路の末端酵素であるグロノラクトンオキシダーゼの遺伝子に変異が生じ、それが機能しなくなったため、ヒトにとってのビタミンとなった（Linster & Van Schaftingen, 2007）。アスコルビン酸を合成する能力を失った動物は、互いに系統的な関係を持たない。これらの動物には、非ヒト霊長類、モルモット、カピバラ、一部の鳥類や魚類が含まれる（Chaudhuri & Chatterjee, 1969, Chatterjee, 1973, Cueto et al., 2000）。アスコルビン酸が欠乏すると壊血病という致命的な病気が発生するが、これはビタミンCの投与によってのみ治癒することができる。
この論文では、人間の健康に関係するビタミンCの生物学の一般的な側面について概説する。ビタミンCについては、他のところで広くレビューされているものについては、ここでは簡単に述べるにとどめる。例えば、ビタミンCの測定を正確かつ精密に行うための適切なサンプル処理と測定法の信頼性の重要性(Levine et al., 1999b)、抗酸化物質としてのビタミンCの役割 (Padayatty et al., 2003)、薬学的（大量）静脈内投与によるビタミンCの化学と生態 (Levine et al., 2011) (Parrow et al., 2013)が含まれる。ビタミンCの摂取や補給が生理的パラメーター、バイオマーカー、臨床的エンドポイントに及ぼす影響については、数多くの疫学研究や介入研究が行われてきた。一般に、これらの研究では、ビタミンCの摂取に起因する効果は認められないか、あるいは曖昧な結果が報告されている。これらの結果をここで詳細に検討することはしないが、我々は研究の計画と解釈において用量と濃度の関係が重要であることを強調する。ゴルディロックスが明快に表現したように、濃度や量を「ちょうどよく」することについては、全体を通して議論されている。添付の図と図の説明文はほぼ自己完結しており、原稿中の図資料の繰り返しは最小限にとどめている。
壊血病の歴史とビタミンCの発見
壊血病は古代から知られていたが(Clemeston, 1989)、過去500年間に大規模な死亡の原因として注目されるようになった。壊血病は、北欧の陸軍や都市で、特に冬場や籠城戦の際に大被害をもたらした。大航海時代には、壊血病は航海を制限する主要因となり、多くの船員が2〜3ヶ月の航海で死亡することがしばしばあった。リンドは、おそらく最初の対照臨床試験で、壊血病が柑橘類によって治癒することを示した（Lind, 1953b）。しかし、この単純な治療法は、数十年の間、広く使われることはなかった。この発見は、現存する科学的知見と合致せず、また、既存の疾病原因説には栄養不足という概念がなかったからである。アスコルビン酸は、1928年にAlbert Szent-Gyorgyiによって初めて単離され、1932年にSzent-GyorgyiとKingによって抗壊血病因子であることが示された（Svirbely & Szent-Gyorgyi, 1932, King & Waugh, 1932）。
壊血病
壊血病の最も初期の症状は微妙なもので、James Lindが壊血病に関する論文(1753)でlassitudeと表現している(Lind, 1953b)。海に出て1、2ヶ月で発症する船乗りの苦悩は予測できた。初期には船員は自発性や労働意欲を失っていたが、強制されれば普通に働くことができた。現在では、フランク壊血病はまれであるが、完全な形で顕著な徴候や症状を示すようになった。これらには、心気症およびうつ病、巻き毛を伴う毛包周囲角化症、腫脹および破砕性の歯肉、貧血、点状出血、紅斑および紫斑、関節痛および/または関節液浸出、古傷の破壊、皮膚、皮下組織、筋肉、関節および骨膜下出血への出血、発熱、息切れ、感染および錯乱がある（Hodges他、1971、Hood他、1970年）。一部の症状や徴候のみを呈する場合もあり、このような場合、当初は診断が見落とされることが多い(Bernardino et al., 2012)。複数のビタミン欠乏がある場合（Blanchardら、2014）、あるいは呼吸困難などの非定型症状が優勢な場合（Kupari & Rapola、2012）、臨床像が混乱する。未治療の場合、致死的な状態です。
壊血病が発症する決定的なビタミンC血漿低濃度は存在しない。放射性同位元素で標識したビタミンCを用いた研究では、健康な人の体内貯蔵量は約1500mgであると予測されている。壊血病はこれが300mg以下になると発症すると考えられており（Hodgesら、1971）、血漿中のビタミンC濃度は10μM未満である。しかし、これらの実験は、ビタミンCの測定が、ビタミンCだけでなく他の未知の妨害物質を検出する比色分析法であった時代に行われたものである。ビタミンCの過大評価は、測定されたビタミンC濃度が低いほど顕著であった（Bakerら、1969年、Bakerら、1971年、Hodgesら、1971年）。現代のビタミンC測定法は、より正確で精密なものである。これらは一般に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いてビタミンCを他の物質から分離し、フローバイ電気化学（アンペロメトリー）、フロースルー電気化学（クーロメトリー）、紫外線（UV）、蛍光などでビタミンCを検出・測定する。最近では、質量分析も液体クロマトグラフィーと結合したビタミンC検出ツール（LC-MSという）（Leveque他、2000、Szultka他、2014、Gentili他、2008）である。現在、最も特徴的な方法は、電気化学検出器を備えたHPLCである(Levine et al., 1999b)。したがって、不正確な測定法のために、壊血病の血漿ビタミンC濃度の測定は、真の値より2～3倍高い値を示していた可能性がある。最新のHPLC電気化学分析法を用いた消耗型-補給型研究では、健康な若い男女は壊血病にならずに血漿ビタミンC濃度が8μMに達した（Levineら, 1996b, Levineら, 2001b）。したがって、壊血病は血漿ビタミンC濃度の低さによって確認される臨床診断であるが、まだ確定的な診断濃度はない。10μM以下では壊血病の初期症状には遠く及ばないが、身体的徴候はもっと低い値、おそらく3-5μM程度で初めて現れると思われる。疫学的研究では、血漿中のビタミンC濃度が11.4μM（0.2mg/dl）未満であれば、欠乏症と見なされる（Jacobら、1987、Schleicherら、2009）。
その機能 添加物のそれは生きている生物の中のvitamin C とは異なる。
ビタミンCの化学的性質と代謝
ビタミンCは、化学的には電子供与体、すなわち還元剤であり、アスコルビン酸からの電子が既知のすべての生理作用を担っている。ビタミンCの化学的性質は図1に示す通りである。ビタミンCの電子は酸化種、すなわちオキシダントを還元することができるので、ビタミンCはしばしば抗酸化物質と呼ばれるが、この用語は誤解を招く。アスコルビン酸の電子は、銅や鉄などの金属を還元し、スーパーオキシドや過酸化水素を生成して、活性酸素種を発生させることがある。このように、ある状況下では、アスコルビン酸塩は、還元剤としての作用を通じて、オキシダントを生成します。この化学反応は、ミリモル単位の薬理学的なアスコルビン酸濃度が血漿および細胞外液で達成された場合に生体内で起こり、金属が存在する場合には細胞培養液中のアスコルビン酸の生理的濃度でも起こり得る（Parrowら、2013年）。
図1
図1
アスコルビン酸の代謝
アスコルビン酸は順次電子を失っていく。1 つの電子が失われると、最初の生成物はアスコルビン酸ラジカルとなります。ほとんどのラジカル種に 1 ミリ秒よりより少し短い寿命があります。アスコルビン酸ラジカルは、酸素と電子受容体、特に鉄の不在に応じて、半減期が数秒、あるいは数分になることがあるという点で異なります（Buettner、1993年）。例えば、ある条件下では、アスコルビン酸ラジカルは血液や細胞外液のサンプルで測定することができる（Chen et al.、2007）。第二電子が失われると、アスコルビン酸フリーラジカルと比較して、より安定な種が形成される。形成された種はデヒドロアスコルビン酸であり、水和および無水形態で存在する。後述するように、デヒドロアスコルビン酸は促進グルコーストランスポーターに親和性を持ち、多くのトランスポーターによって輸送される（Corpeら、2013）（Rumseyら、1997）（Rumseyら、2000a）。デヒドロアスコルビン酸もアスコルビン酸ラジカルもアスコルビン酸に可逆的に還元される。デヒドロアスコルビン酸の半減期は、加水分解性リングの破裂のために、わずか数分である。環構造が失われると、生成物の 2,3 ジケトグロン酸は、その前駆体であるデヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸ラジカル、およびアスコルビン酸を再構成することができなくなる。
Known and postulated actions of vitamin C
ビタミンCの既知の作用と推測される作用
酵素学とビタミンC
前述のように、ビタミンCの既知および推定の作用はすべて、ビタミンCが電子供与体であり、したがって還元剤であるという単一の化学的性質によって説明される。最もよく知られた作用は、酵素の補酵素としての作用であり、実際の共基質となる作用も含まれる。アスコルビン酸塩は 15 の哺乳類および 3 つの菌類の酵素のための電子ドナーとして機能します（Englard 及び Seifter、1986 年、Levine、1986 年）。これらには2つのモノオキシゲナーゼ（ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ、ペプチジルグリシンα-アミド化モノオキシゲナーゼ）、12のジオキシゲナーゼ（6つのプロリル4-ヒドロキシラーゼ、プロリル3-ヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼ、アスパラギニルヒドロキシラーゼ、トリメチルリシンヒドロキシラーゼ、γ-ブチルベタインヒドロキシラーゼ、4-ハイドロキシフェニルピルベートジ・オキシゲナーゼ）および一つのアミン酸化酵素が含まれています。これらの酵素反応の詳細とアスコルビン酸の役割については、他の場所で説明されているが（Levineら、2006）、以下に簡単に要約する。
表1
表1
哺乳類と菌類におけるビタミンCの推定される酵素的および非酵素的作用を表に示す。哺乳類の3つの酵素（プロリル4-ヒドロキシラーゼ、プロリル3-ヒドロキシラーゼ、リシルヒドロキシラーゼ）はコラーゲン生合成に関与している。プロリル4-ヒドロキシラーゼは...
ドパミンβ水酸化酵素は、神経分泌小胞および副腎クロマフィン顆粒に存在し（Levineら、1941b）、神経系および副腎におけるノルエピネフリンの合成に必要である。酸素分子とアスコルビン酸を必要とし（Levine et al., 1941b）、この反応によってアスコルビン酸が消費される（Fleming & Kent, 1991, Stewart & Klinman, 1988）。分泌小胞に存在するペプチジルグリシンα-アミデートモノオキシゲナーゼは、多くのペプチドホルモンをアミデートして生物学的に活性化するのに必要です (Eipper & Mains, 1991, Glembotski, 1986) (Prigge et al., 2000) (Kumar et al., 2015). これらには、多くの視床下部ホルモンや消化管ホルモンが含まれる。この酵素は分子状酸素、銅、アスコルビン酸を必要とし、アスコルビン酸を消費する（Prigge et al.、2000）。しかし、アミド化については、in vitroでは他の電子供与体がアスコルビン酸に代わることができる（Priggeら、2000）。トリメチルリジンヒドロキシラーゼとγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼは、必須アミノ酸のリジンとメチオニンからカルニチンを合成するのに必要な酵素である。この酵素は鉄、α-ケトグルタル酸、還元剤を必要とし、その中でも少なくともin vitroではアスコルビン酸が最適である（Dunnら、1984）。カルニチンは食事から得られ、また体内で合成されるため、これら2つの供給源の相対的重要性、およびその合成におけるアスコルビン酸の役割は、in vivoで特徴付けることが難しい（Thoma & Henderson, 1984, Englard & Seifter, 1986）（Rebouche, 1991a, Rebouche, 1991b）. 4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼは、チロシンの異化に必要である（Lindbladら、1970）。アスコルビン酸の欠乏は、チロシン異化の障害とチロシンの血漿濃度の上昇をもたらす（Englard & Seifter, 1986, Levine et al, 1941a）。アスコルビン酸がプロリルまたはリシル水酸化に関与する酵素の場合、アスコルビン酸は共基質ではなく補因子として作用する。補酵素として、生成物分子の数は利用されるアスコルビン酸の分子数に比べて非常に過剰である。なお、プロリル4水酸化酵素には、コラーゲン水酸化に関与する3つのアイソザイムと、HIF -1 の水酸化に関与するもう一つのアイソザイムがある (Pekkala et al., 2003) (Myllyharju, 2008)。
コラーゲンの水酸化
壊血病の一般的な症状には、創傷剥離、創傷治癒不良、歯のゆるみなどがあり、これらはすべて結合組織の欠損を示唆している (Lind, 1953a) (Crandon et al., 1940, Hirschmann & Raugi, 1999)。コラーゲンは、結合組織に構造的強度を与える。ビタミンCは、プロコラーゲンの酵素的（Peterkofsky, 1991）翻訳後修飾を触媒して、コラーゲン産生細胞によって構造的に正常なコラーゲンを十分な量生成し分泌する（Kivirikko & Myllyla, 1985）（Prockop & Kivirikko, 1995）。小胞体で合成されるプレコラーゲンは、プロリンを多く含むアミノ酸の繰り返しから構成されている。特定のプロリルおよびリシル残基が水酸化され、プロリンは3ヒドロキシプロリンまたは4ヒドロキシプロリンに、リジンはヒドロキシリシンに変換される。プロリル3-ヒドロキシラーゼ、プロリル4-ヒドロキシラーゼ、リジルヒドロキシラーゼ (Peterkofsky, 1991) (Prockop & Kivirikko, 1995) (Pekkala et al., 2003) が触媒する反応には、補酵素としてビタミンCが必要である。水酸化はコラーゲンの安定な三重らせん構造の形成を助け、ゴルジ装置に運ばれ、最終的には分泌顆粒によって分泌される。水酸化がない場合、プロコラーゲンの分泌は減少し（Peterkofsky, 1991）、おそらくより速い分解を受ける。しかし、ビタミンCがない場合でも、ある程度の水酸化は起こりうる (Parsons et al., 2006)。分泌されたプロコラーゲンは酵素的に切断され、トロポコラーゲンとなり、細胞外空間に自発的にコラーゲン線維を形成する。この線維が分子間のコラーゲン架橋を形成し、コラーゲンに構造的強度を与えている。水酸化に対するその効果とは無関係に、アスコルビン酸塩はコラーゲン合成を刺激することがある（Geesinら、1988）（Sullivanら、1994）。コラーゲン合成は、scorbutic 動物で減少するかもしれない（Peterkofsky, 1991, Kippら, 1996, Tsuchiya & Bates, 2003）。コラーゲン架橋の減少は、モルモットにおけるビタミンC欠乏のマーカーとなりうるが（Tsuchiya & Bates, 2003）、これはビタミンC欠乏に特異的なものではないかもしれない。ヒトの壊血病の多くの特徴は、結合組織の弱体化に起因するようであるが、これらの病変がコラーゲン合成の欠陥に起因することは示されていない。
HIF-1の水酸化
コラーゲンの水酸化における役割に加え、ビタミンCは、Hypoxia Inducible Factor -1 alpha (HIF-1α) の特定のプロリン残基を、別のプロリル4水酸化酵素によって水酸化する役割も担っている可能性がある。これらの酵素は非ヘム鉄を含み、アスコルビン酸、分子酸素、および2-オキソグルタル酸を必要とする（Bruick & McKnight, 2001）（Myllyharju, 2003）（Pekkala et al, 2003）（Knowles et al, 2003）（Dengler et al, 2014）。HIF-1は、多細胞動物における酸素センシングの鍵となる転写因子である（Taabazuing et al, 2014）（Semenza, 2014）。酸素調節を行うαサブユニットと構成的に発現するβサブユニットからなる（Dengler et al.、2014）。正常な酸素濃度を含む正常な条件下では、HIF-1αは特定のプロリンおよびアスパラギン残基で水酸化される。水酸化されたHIF -1 αは、プロテアソームによる分解の標的となる（Dengler et al.、2014）。低酸素条件下では、大気中の酸素が減少した場合でも、局所的な虚血による場合でも、水酸化が抑制され、HIF-1 αは安定化される。金属による培養細胞のアスコルビン酸欠乏も水酸化を阻害し、HIF-1αを安定化させるが（Kaczmarekら、2007）、金属はこの系に他の影響を及ぼす可能性もある。水酸化されていないHIF-1αは安定であるため、核に移行するのに十分な時間蓄積される。核内では、HIF-1αはHIF-1βと二量体を形成し、二量体はDNAに結合して標的遺伝子を転写する（Denglerら、2014年）。灌流した肺では、HIF-1 αは低酸素により1時間で誘導されるが、正常酸素条件下では数分で分解される（Yu et al.） HIF-1は、シス作用の調節要素であるHypoxia Response Element内のDNAの一部に結合することにより、遺伝子の転写を活性化する。HIF-1は数百の遺伝子を制御する可能性があるが、制御は細胞種ごとに少数の特定遺伝子に限定される（Semenza, 2011）（Taabazuing et al.，2014）。HIF-1は、正常な生理機能において重要な役割を担っている（Semenza, 2011）。他の場所でレビューされているように、HIF-1は、赤血球造血の制御（Frankeら、2013）；肺疾患（Shimoda & Semenza、2011）；心臓疾患（Semenza、2014）；糖尿病（Catarina、2014、Ichiki & Sunagawa、2014）；および癌（Semenza、2013）（Borsiら、2015） 。これらの状態はすべて、組織レベルでの酸素欠乏の程度は様々です。アスコルビン酸は、in vitro で HIF-1 に対して実証的な効果を有しています。アスコルビン酸塩は、細胞培養におけるHIF -1活性を阻害し、HIF-1刺激に特異的な遺伝子転写を防止した（Vissersら、2007、Kuiperら、2014）。アスコルビン酸塩と鉄を補給した）健常者における低酸素によって誘発された収縮期肺動脈圧の上昇は、ビタミンCの静脈内投与によって影響を受けなかったが、鉄の注入によって減少した（Talbotら、2014年）。これらの効果がHIF-1によって媒介されたかどうかは不明であるが、HIFは低酸素誘導肺高血圧のメディエーターであると考えられている（Shimoda & Laurie, 2014）。
HIF-1は、Factor Inhibiting HIF (FIH)によって負の制御を受ける。FIHは水酸化酵素であり、アスコルビン酸も必要とする（Flashman et al.、2010）。FIHはHIF 1上のアスパラギンおよび/またはアスパラギン酸残基、さらに構造タンパク質アンキリンの水酸化に必要なようである。in vitroでの水酸化は、電子供与体であるアスコルビン酸またはアスコルビン酸アナログに依存していた(Yang et al., 2011b)。他の細胞内電子供与体、すなわちグルタチオンで十分であるかどうかは不明である。HIF-1およびその酵素経路に関与する因子を操作することは、魅力的な治療標的を提示する可能性がある（Myllyharju, 2008）。HIF-1を介して作用する可能性のあるヒトの生理学および病態におけるアスコルビン酸の生体内における濃度依存的な役割は、まだ知られていない。
Enzymology and vitamin C
As just described, all known and postulated actions of vitamin C Table 1 are accounted for by a single chemical property: that AA is an electron donor and thus a reducing agent. The most well characterized actions are those as an enzyme cofactor, including those in which it is an actual cosubstrate. Ascorbate acts as an electron donor for fifteen mammalian and three fungal enzymes (Englard & Seifter, 1986, Levine, 1986). These include two monooxygenases (Dopamine β-Hydroxylase, Peptidylglycine α-Amidating Monooxygenase), twelve dioxygenases (6 Prolyl 4-Hydroxylases; Prolyl 3-Hydroxylase; Lysyl Hydroxylase; Asparaginyl hydroxylase; Trimethyllysine Hydroxylase; γ-Butyrobetaine Hydroxylase; and 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase) and one amine oxidase. Although details of these enzyme reactions and the role of ascorbate are described elsewhere (Levine et al., 2006) a brief summary follows.
Table 1
Table 1
Putative enzymatic and non-enzymatic effects of vitamin C in mammals and fungi are listed in the table. Three mammalian enzymes (prolyl 4-hydroxylase, prolyl 3-hydroxylase and lysyl hydroxylase) take part in collagen biosynthesis. Prolyl 4-hydroxylase ...
Dopamine β-Hydroxylase, found in neurosecretory vesicles and in adrenal chromaffin granules (Levine et al., 1941b) is necessary for the synthesis of norepinephrine in the nervous system and in the adrenal glands. It requires molecular oxygen and ascorbate (Levine et al., 1941b), and the reaction consumes ascorbate (Fleming & Kent, 1991, Stewart & Klinman, 1988). Peptidylglycine α-Amidating Monooxygenase, found in secretory vesicles is required to amidate many peptide hormones (Eipper & Mains, 1991, Glembotski, 1986) (Prigge et al., 2000) (Kumar et al., 2015) to make them biologically active. These include many hypothalamic and gastrointestinal hormones. The enzyme requires molecular oxygen, copper and ascorbate, and consumes ascorbate (Prigge et al., 2000). However, for amidation, other electron donors can replace ascorbate in vitro (Prigge et al., 2000). Trimethyllysine Hydroxylase and γ-Butyrobetaine Hydroxylases are required for carnitine synthesis from the essential amino acids lysine and methionine. The enzyme requires iron, α-ketoglutarate and a reductant, of which ascorbate is the most optimal, at least in vitro (Dunn et al., 1984). Because carnitine is obtained from diet and also synthesized in the body, the relative importance of these two sources, and the role of ascorbate in its synthesis are difficult to characterize in vivo (Thoma & Henderson, 1984, Englard & Seifter, 1986) (Rebouche, 1991a, Rebouche, 1991b). 4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase is required for the catabolism of tyrosine (Lindblad et al., 1970). Ascorbate deficiency leads to impaired tyrosine catabolism and increased plasma concentrations of tyrosine (Englard & Seifter, 1986, Levine et al., 1941a).
For enzymes in which ascorbate is involved in prolyl or lysyl hydroxylation, ascorbate acts as a cofactor rather than a cosubstrate. As a cofactor, the number of product molecules generated is in great excess in comparison to number of molecules of ascorbate utilized. Note that prolyl 4 hydroxylase has three isoenzymes involved in collagen hydroxylation and another three in the hydroxylation of HIF -1 (Pekkala et al., 2003) (Myllyharju, 2008).
Collagen Hydroxylation
Common symptoms of scurvy include wound dehiscence, poor wound healing and loosening of teeth, all pointing to defects in connective tissue (Lind, 1953a) (Crandon et al., 1940, Hirschmann & Raugi, 1999). Collagen provides connective tissue with structural strength. Vitamin C catalyzes enzymatic (Peterkofsky, 1991) post-translational modification of procollagen to produce and secrete adequate amounts of structurally normal collagen by collagen producing cells (Kivirikko & Myllyla, 1985) (Prockop & Kivirikko, 1995). Precollagen, synthesized in the endoplasmic reticulum, consists of amino acid repeats rich in proline. Specific prolyl and lysyl residues are hydroxylated, proline is converted to either 3 hydroxyproline or 4 hydroxyproline, and lysine is converted to hydroxylysine. The reactions catalyzed by prolyl 3-hydroxylase, prolyl 4-hydroxylase, and lysyl hydroxylase (Peterkofsky, 1991) (Prockop & Kivirikko, 1995) (Pekkala et al., 2003) require vitamin C as a cofactor. Hydroxylation aids in the formation of the stable triple helical structure of collagen, which is transported to the Golgi apparatus and eventually secreted by secretory granules. In the absence of hydroxylation, secretion of procollagen decreases (Peterkofsky, 1991) and it probably undergoes faster degradation. However, some hydroxylation can occur even in the absence of vitamin C (Parsons et al., 2006). Secreted procollagen is enzymatically cleaved to form tropocollagen that spontaneously forms collagen fibrils in the extracellular space. These fibrils form intermolecular collagen cross links, giving collagen its structural strength. Independent of its effects on hydroxylation, ascorbate may stimulate collagen synthesis (Geesin et al., 1988) (Sullivan et al., 1994). Collagen synthesis may be decreased in scorbutic animals (Peterkofsky, 1991, Kipp et al., 1996, Tsuchiya & Bates, 2003). Reduced collagen cross links may be a marker of vitamin C deficiency in the guinea pig (Tsuchiya & Bates, 2003) but this may not be specific to vitamin C deficiency. Though many features of human scurvy appear to be due to weakening of connective tissue, it has not been shown that these lesions are due to defective collagen synthesis.
HIF-1 Hydroxylation
In addition to its role in the hydroxylation of collagen, vitamin C may also play a role in the hydroxylation of specific proline residues in Hypoxia Inducible Factor -1 alpha (HIF-1α) by a separate set of prolyl 4 hydroxylases. These enzymes contain non haeme iron, and require ascorbate, molecular oxygen, and 2-oxoglutarate (Bruick & McKnight, 2001) (Myllyharju, 2003) (Pekkala et al., 2003) (Knowles et al., 2003) (Dengler et al., 2014). HIF-1 is a transcription factor that is a key to oxygen sensing in multicellular animals (Taabazuing et al., 2014) (Semenza, 2014). It consists of an oxygen regulated α subunit and a constitutively expressed β subunit (Dengler et al., 2014). Under normal conditions, including normal oxygen tension, HIF-1α is hydroxylated at specific proline and asparagine residues. Hydroxylated HIF -1 α is targeted for degradation by proteasomes (Dengler et al., 2014). Under hypoxic conditions, whether due to reduced atmospheric oxygen or due to local ischemia, hydroxylation is inhibited and HIF-1 α is stabilized. Metal induced ascorbate depletion in cultured cells also inhibits hydroxylation and stabilizes HIF-1 α (Kaczmarek et al., 2007) though metals may also have other effects on this system. Because unhydroxylated HIF-1α is stable, it accumulates long enough to translocate into the nucleus. In the nucleus, HIF-1α forms dimers with HIF-1 β, and the dimer binds to DNA to transcribe target genes (Dengler et al., 2014). In perfused lungs, HIF-1 α was induced by hypoxia in one hour but was degraded under normoxic conditions in minutes (Yu et al., 1998). HIF-1 activates gene transcription by binding to parts of the DNA within the Hypoxia Response Element, a cis acting regulatory element. HIF-1 may regulate several hundred genes, but regulation is limited to a smaller number of specific genes for each cell type (Semenza, 2011) (Taabazuing et al., 2014). HIF-1 plays an important role in normal physiology (Semenza, 2011). As reviewed elsewhere, HIF-1 has a role in the control of erythropoiesis (Franke et al., 2013); in lung disease (Shimoda & Semenza, 2011); in heart disease (Semenza, 2014); in diabetes (Catrina, 2014, Ichiki & Sunagawa, 2014); and in cancer (Semenza, 2013) (Borsi et al., 2015) . All of these conditions have varying degrees of oxygen deprivation at the tissue level. Ascorbate has demonstrable effects on HIF-1 in vitro. Ascorbate inhibited HIF -1 activity in cell culture and prevented gene transcription specific to HIF-1 stimulation (Vissers et al., 2007, Kuiper et al., 2014). Increased systolic pulmonary artery pressure induced by hypoxia in (ascorbate and iron replete) healthy subjects was unaffected by intravenously administered vitamin C but was reduced by iron infusion (Talbot et al., 2014). Whether these effects were mediated by HIF-1 is not known though HIFs are thought to be mediators of hypoxia induced pulmonary hypertension (Shimoda & Laurie, 2014).
HIF-1 in turn is negatively regulated by Factor Inhibiting HIF (FIH). FIH is a hydroxylase that also requires ascorbate (Flashman et al., 2010). FIH appears necessary for hydroxylation of asparagine and/or aspartate residues on HIF 1, and also on the structural protein ankyrin. Hydroxylation in vitro was dependent on ascorbate or ascorbate analogs that are electron donors (Yang et al., 2011b). It is not known if other intracellular electron donors will suffice, ie. glutathione. Manipulation of HIF-1 and the factors involved in its enzymatic pathways may present attractive therapeutic targets (Myllyharju, 2008). The concentration -dependent role of ascorbate in vivo in human physiology and disease states that may potentially act via HIF-1 are not yet known.
