The aging skin microenvironment dictates stem cell behavior
加齢に伴う皮膚微小環境が幹細胞の挙動を規定する
PNAS February 24, 2020 117 (10) 5339-5350
https://doi.org/10.1073/pnas.1901720117
老化のプロセスの中で幹細胞はどう影響するのか、という内容。
背景
そもそも、成人の組織には、創傷の修復と適応に不可欠な組織特異的幹細胞 (Stem Cell) が存在し、臓器の劣化は、これらの常在 SC の喪失または系統の偏りに起因することが多いとされている。哺乳類では、中でも、老化した皮膚においては毛周期の顕著な減少と脱毛斑の出現など外見上の変化を伴うため観察しやすいという研究上のメリットがある。そこで、毛包幹細胞 (HFSC)の運命は老化中にどのように変化するのか、老化中に失われるのか、あるいは分化することで新たに抗老化プロセスを担い表皮の運命に変化するのか、さらにはその運命を左右する因子は何なのか探究する。
要旨
単一細胞 RNA シーケンシングを使用して、HFSC 毛包幹細胞の老化過程の変化を調べた。幹細胞の数は減少していたが、老化した HFSC は残存し、そのアイデンティティを維持し、表皮の運命に移行する明らかな兆候は示さなかった。しかし、特に細胞外マトリックス遺伝子で転写変化が顕著に見られ、老化した SC ニッチの深刻な構造的変動を伴っていた。
また、常在免疫細胞、感覚ニューロン、立毛筋など、 SC ニッチ（周辺の非上皮性細胞からなる微小環境）に存在する多くの非上皮細胞タイプで顕著な老化関連の発現変化が認められた。
SC ニッチの各コンポーネントは、毛包HF 再生に影響を与えることが知られているので、若い HFSC を動員してニッチから取り出し、毛包に対する創傷治癒実験を行ったところ、老化した皮膚に移植した場合には創傷治癒ができないことがわかった。しかし、興味深いことに、生体内での移植試験では、若い真皮で支えられた老化した HFSC は HF を再生したが、若い HFSC は老化した真皮と組み合わせると HF を再生できなかった。これらの結果を合わせると、幹細胞とニッチ相互作用の重要性が強調された。
つまり、SC ニッチ微小環境の若さが幹細胞の特性と組織の健康と適応性を決定する上で主要な役割を果たすということがわかった。
（幹細胞は単独で若返りの泉というわけではなく、その周辺にある非上皮性の微小環境＝ニッチによって運命付けられ、老化幹細胞と若いニッチを合わせると元来の創傷治癒や抗老化の機能を発揮することができた。すなわち、ニッチが老化過程での幹細胞の働きに大きく影響している）
abbreviations;
SC: stem cell 幹細胞
SC niche: stem cell niche 幹細胞ニッチー毛包周辺の非上皮細胞群
niche: ニッチ、microenvironment (微小環境)
HF: hair follicle 毛包
HFSC: hair follicle stem cell 毛包幹細胞
APM: arrecter pilli muscle 立毛筋
結果
１ 老化した皮膚の HFSC は、系統のアイデンティティを維持する
まず、2 歳 (高齢) および 2 か月齢 (若齢) の C57BL/6 マウスの皮膚上皮内の加齢に伴うトランスクリプトームの変化を調査した。休止期 (休止期) の背中の皮膚 HF 毛包に注目した。
皮膚から上皮を解剖した後、FACS を使用して死んだ細胞を取り除き、さらに免疫細胞、メラノサイト、線維芽細胞、および内皮細胞を除外した。次に、皮膚上皮系統が豊富な単一細胞を捕捉し、10X Genomics プラットフォームを使用して単一細胞 RNA シーケンス (scRNA-seq) を実行した。若い皮膚上皮と老化した皮膚上皮の両方から、異なる休止期細胞集団を分離し、確立された系統特異的マーカーを使用して、以下の集団のアイデンティティを区別した（図1A）：
バルジHFSC、バルジ基底部の「プライミング」HFSC（毛胚、HG）、皮脂腺、峡部（バルジ腺と皮脂腺の間のHF領域）、漏斗部（表皮に隣接する上部HF領域）、基底上HF細胞、および表皮の基底細胞と基底上細胞（図1BおよびSI付録、図S1）。
（バルジHFSCは若いマウスと高齢マウスと同パターンー毛包幹細胞のマーカーを示した。例えばHFSCマーカーK24（A）とSOX9（B）、EpdSCマーカーKLF5（B）、Epd分化マーカーK10（C）などの発現様式。つまり、その個性は老化した個体でも若くても変わりはなく、いずれも幹細胞としては同等に維持されているのではないかと考えられたー幹細胞としての個性＝アイデンティティは保たれていた）
２ 老化した HFSC は ECM 遺伝子発現とバルジ構造に顕著な変化を示す
老化したバルジ HFSC はアイデンティティに忠実であったが、老化したトランスクリプトームは若いトランスクリプトームと区別するいくつかの変化が見出された。
最も大きく変化したトランスクリプトは、ECM、基底膜、ECM リモデリング遺伝子、および分泌シグナル伝達因子であった（(図 3 A および B、SI 付録、図 S2B、およびデータセット S1 および S2)。
（加齢HFSCsと若年HFSCsの間で有意に変化したECM遺伝子と分泌因子の階層的クラスタリングを示すヒートマップに示されるような大きな差がみいいだされた。赤は発現増加、青は発現減少。マトリソーム（ECM遺伝子）であることに注目）
また、老齢マウスの皮膚の部位に顕著な脱毛が見られることに着目した。
全層免疫蛍光顕微鏡レベルで詳しく調べたところ、若いバルジと老齢バルジの間にはいくつかの明確な構造上の違いが見られた。
つまり、具体的には、第 2 休止期 (つまり、毛周期の第 2 生後休止期) にある若い HF は、明確な 2 つのバルジ構造を示していた (図 3D)。対照的に、高齢の HF では、多くの場合、単一の隆起のみが表示された (図 3D + ムービー)（高齢では膨らみが一つ）。
このように老化バルジ HFSC の数は減少し、存在する HFSC は不活性であるもののほぼ同様の転写活性を示したが、ECM および ECM リモデリング遺伝子の発現に顕著な変化が見られた。
これらの変化は、バルジ ニッチが構造的完全性を維持できないことと相関しており、この現象が老化した皮膚における毛包 の小型化の根底にある可能性がある。
（高齢と若齢の差はバルジにおけるECM および ECM リモデリング遺伝子の発現減少→老化によるバルジ構造の維持困難→脱毛）
３ 老化した皮膚の微小環境における多面的な変化
これまでのまとめとして、
加齢に伴う毛髪の薄さの背後にある正確なメカニズムとは関係なく、加齢した HFSC は系統のアイデンティティを維持し、毛周期の休止期には非増殖性の状態を維持していた。
しかし、HFSC による ECM 遺伝子発現の顕著な変化と SC ニッチの構造変化は、微小環境の乱れが加齢に伴う HFSC 活性の低下に関係している可能性を示唆している。
この点、一方で、加齢した真皮線維芽細胞と若い真皮線維芽細胞の間に顕著な機能的差異を示す研究結果が最近数多く報告されている。そこで、HFSC 微小環境の加齢に伴う差異をさらに理解するために、HFSC ニッチの構成要素として関与していると考えられる非上皮細胞を調査した。
・老化したバルジニッチにおける顕著な変化は APM arrecter pilli muscle立毛筋にあった。
通常、APM は上部バルジで HF に接続するが、老化した皮膚では APM がバルジから分離しているように見えた (図 4C)。
APM の付着は、若いバルジの SC によって発現される特殊な ECM 成分であるネフロネクチン (NPNT) に依存している。
（ ECM 成分であるネフロネクチンNPNT低下→APM の付着低下→脱毛）
・さらに、CD4+ エフェクター T 細胞集団全体の変化はそれほど有意ではないが、このプール内の制御性 T 細胞 (Treg) のサブセットでは明らかな加齢に伴う減少が見られた (図 4 D および E)。若いマウスでは、Treg が毛周期に刺激を与えるという最近の報告を考慮すると、FOXP3+CD25+CD4+ Treg の加齢に伴う数の減少は特に注目に値する。
したがって、Treg の不足は、加齢に伴う毛周期の低下の重要な要因である可能性がある。
（T 細胞 Treg の不足も関与する可能性）
（幹細胞SCとニッチの間の相互作用で特定したこれらの加齢に伴う変化は、皮膚の老化中の 幹細胞機能低下に直接的または間接的に寄与する可能性がある）
４ 創傷修復中の老化した皮膚における HF 再生の欠陥
背景：老化した表皮 SC が全層創傷で表皮を再上皮化しようとすると、修復プロセスが著しく遅れるという報告がある。
したがって、今回は部分層ドレメル創傷モデル partial-thickness dremel wound model に着目した (材料と方法、図 5A)。この方法では、移動して動員された幹細胞 HFSC は系統不忠実状態 (35) に入り、表皮の修復を促進する。
さらに、若いマウスでは、部分層創傷によって誘発されるストレス反応が HF 再生を刺激するため、このモデルは老化した HFSC の効力を試すのに特に魅力的なモデルとなる (図 5A)。
実験：毛髪の再生をよりよく監視するために、まず休止期の若いマウスと老齢マウスの毛を剃り、次に背中の皮膚に部分的な厚さの創傷を施した。
結果：創傷後 2 か月で、若いマウスの創傷のない領域が通常の毛周期を開始したときでさえ (図 5D、若いマウスの白い点線、図 5E、「創傷のない若いマウス」)、老化した皮膚は、創傷の有無にかかわらず、新しい毛皮を再生する兆候をまだ示さなかった (図 5 DとE）
（老化マウスでは、２週間後、２ヶ月後も休止期に入ったままによる創傷治癒が開始されなかった。これは若いマウスでは２週間後から成長期に入り、さらには２ヶ月後に完全に毛で覆われるよう再生している状況と明白に異なったー図 5 BとD）
さらに、創傷修復プロセスの初期段階を調べた。
創傷から 5 日後、老化した HFSC は組織修復を開始したように見えた (SI 付録、図 S3B)。この時点で、HF の表皮と上部はどちらも組織再生の兆候を示していた (SI 付録、図 S3B、矢印)。これらの結果は、老化した HFSC が、表皮の再上皮化を促進する創傷誘発性のシグナルに依然として反応できることを示している。
だが、この結果は加齢に伴う毛髪再生の欠陥は、老化した休止期皮膚は慢性創傷のような状態に似ているという従来の概念と矛盾しているように思われた。脱毛した皮膚領域内の老化した HF 隆起部には HFSC がまだ存在しており (図 1)、創傷により毛髪サイクルを活性化するよう誘導された (図 5C) ことから、老化した HFSC とその初期の増殖性子孫は毛髪再生プログラムを実行する能力に欠陥があるか、持続性が不足して組織再生タスクが停止している可能性があると推測した。
（幹細胞の機能は老化してもそのアイデンティティーは保たれているが、老化すると休止期から動かなくなって機能しにくくなる、その差は何なのか、可能性は２つにひとつ、毛髪再生プログラムが働かない、あるいは働いでも弱くて持続しないかのどちらかと考えて以下に進んだ）
若い HF と同様に、HF は Shh および Wnt10b を発現した（毛周期の誘発に重要であることが知られている既知のマーカー）。
これらは、HF毛包再生および毛髪成長を促進する毛球内の初期の短命な SC 子孫の重要なマーカーであるShh および Wnt10b の発現を調べてみると、若いマウスも老化マウスもいずれも発現していた (図 6A)。
とはいえ、再生のための分子シグナルは開始されていたものの、創傷後 7 日までに再生した老化した HF は短くなっており、これはおそらく次の毛周期のための SC を収容する外毛根鞘細胞が少ないことを反映している。HF はまた成熟度が低く、これは毛幹とそのチャネル (内毛根鞘) への分化に進む毛球内の短命な HFSC 子孫が少ないことを反映している。
内根鞘マーカーGATA3（C、矢頭）および毛幹マーカーHOXC13（D、矢頭）の免疫蛍光観察により、若齢マウスと比較して老化マウスでは、創傷により誘導されたHFの数が減少していることが明らかになった。
これらのデータを総合すると、老化した HFSC は創傷誘発性成長期促進シグナルに反応し、適切な系統分化経路を実行できると思われる増殖性子孫を生成したことがわかる。ただし、毛周期全体にわたって再生を持続的に促進する能力は低下しており、その結果、部分的な厚さの創傷を受けた老齢マウスでは毛皮を再生することができなかった。
（SC 子孫の重要なマーカーであるShh および Wnt10b の発現を調べてみると、若いマウスも老化マウスもいずれも発現していた。ということは、老化した HFSC は毛周期活性化による創傷誘発性成長期促進シグナルの開始点では反応している。しかしながら、その後老化マウスで創傷後の毛包は短くて数も少なかったのは何故か、HFSCの働き、おそらく持続力に問題があったということではないか）
５ 若齢 HFSC と老齢 HFSC の本質的な違いは、in vitro 培養によって克服できる
これまでの結果から、創傷誘発性組織再生における老齢 HFSC の能力の低さは、HFSC の本質的な活動の低下、または老齢真皮によって提供される組織微小環境の支持力の低さのいずれかが原因である可能性がある。
これらの可能性を区別するために、まず若齢および老齢皮膚から HFSC を分離し、in vitro でその挙動を調べた (SI 付録、図 S4A)。
実際、若い HFSC と同様に、老化した HFSC は培養中に創傷修復中に見られるものと同様の転写変化を起こした。
これには 表皮遺伝子の活性化、HF 遺伝子のダウンレギュレーション、ストレス特異的遺伝子の誘導が含まれた (SI 付録、図 S4B)。
結果を総合すると、若いHFSCsと老化したHFSCsの間には本質的な違いが存在するが、血清や成長因子を豊富に含むin vitroの培養液では、その違いは持続しないことが示唆された。
つまり、老化した HFSC が体外で系統不忠実状態を再現する能力は、老化した HFSC が本来のバルジ微小環境外で生存するために必要なこのプログラムを実行できるという、以前の体内での観察とよく一致していた。
（老化した幹細胞もアイデンティティーを維持しており、本質的に差がないのでいつでも修復や抗老化に参加して若いそれと同等の働きを示すことができるはずだがーそうならない、両者の大きな違いは何から生じるのかー以下へと続く）
６老化した HFSC は、生体内移植中に新生児真皮によって若返らせることができる
我々の培養研究では、成長を促進する微小環境が、集団内の少なくとも一部の HFSC の固有の加齢関連欠陥を上書きする可能性があることが示唆された。
老化した HFSC 集団全体の適応度を生理学的観点から評価するために、老化した皮膚と若い皮膚から新鮮に分離された FACS 精製 HFSC で移植を行った (図 7A)。
驚くべきことに、
・新生児真皮細胞を移植すると、若い HFSC と高齢 HFSC の両方が、無毛ヌードマウスの受容体で効率的に毛髪を生成した (図 7B)。
・これらの移植片のホールマウント画像では、若い HFSC と高齢 HFSC の両方から形成された多数の HF の存在がさらに明らかになった (図 7 C と D、SI 付録、図 S5)。
・対照的に、若い HFSC も高齢 HFSC も、高齢皮膚真皮の細胞を移植すると毛髪や HF を再生しなかった (図 7 B と D)。
これらの観察結果を総合すると、高齢皮膚微小環境が幹細胞の活動に対する大きな障害であり、さらに、新生児真皮は、毛髪の成長における本来の加齢による違いを克服し、高齢 HFSC を若々しい行動に若返らせることができることを示している。
（幹細胞そのものよりもその微小環境である真皮の細胞群の働きがその機能を左右している）
考察
安静状態では、老化したバルジ HFSC はアイデンティティを維持している
加齢中のバルジの構造変化、ECM
ECM (マトリソーム) 転写物の顕著な加齢関連の変化は、私たちが観察したバルジ構造の変化を考えると興味深い。また、E カドヘリンと Col17a1がバルジの構造と形状を維持する機能を果たす可能性が高いという以前の研究結果をがあり、C elegans では、ECM、特にコラーゲンが、インスリン/IGF1 シグナル伝達および NRF2 転写活性の下流で老化の重要な調節因子であることが報告されている。さらに、ECM はヒトの皮膚の老化中にも変化する。これは、これが生物の老化を調節する保存された経路である可能性があることを示唆している。
・間質BNPと休止期の制御
脱毛した皮膚領域の自然に老化したバルジ HFSC は休止期を維持し、不活性である可能性があることが知られているが、毛周期の休止期が加齢とともに増加しするのは間質 BMP の増加によるところが大きい。その一因は間質 BMP レベルの増加によるもので、BMP シグナル伝達の増加の下流に関係する NFATc1 転写レベルは、脱毛した皮膚の老化したバルジでは有意に変化しないものの、転写後または翻訳後修飾に敏感であり、老化静止表現型に寄与する可能性が示唆されている。
ニッチ構成要素の変化と HFSC とのコミュニケーション
・WNT シグナル伝達が毛周期の誘発に重要であることは既に確立されているが、強力な WNT 阻害剤をコードする Wif1 の上昇レベルは興味深いものであった。
・加齢した HFSC では、ニューロンの神経栄養因子および走化性因子をコードする Bdnf1 転写物のレベルも上昇しており (58)、これがバルジ上部の領域からバルジ自体への感覚ニューロンの誤った配置を説明できる可能性がある。
・ネフロネクチン (Npnt) を含む ECM 遺伝子の変化は、APM arrecter pilli muscle直筋をバルジ ニッチに固定するネフロネクチン:インテグリン軸を考慮すると、APM の混乱に関連している可能性がある。
・老化した皮膚では Treg が減少するという私たちの発見は、皮膚の自然免疫細胞と獲得免疫細胞の両方における加齢に伴う変化のリストに、さらにもう 1 つの要素を追加するものである。HF とそのニッチにおけるこれらの加齢に伴う変化の一部は、疾患関連の脱毛症で起こる変化と類似点があり、HF の小型化と Treg の減少の両方が報告されている。
組織微小環境は SC の本質的な違いを無効にし、老化した HFSC を若返らせる
・私たちの研究結果はニッチ環境が HFSC の行動に与える影響を強調している。
私評
加齢的変化は全身の機能低下の状態を反映しているが、外観にも現れる。その点、皮膚は私たちの体の最外層を覆っており、生物学的年齢を測る上でわかりやすい臓器と言える。具体的な表現系としては創傷治癒遅延や白髪、バリア機能低下による肌の荒れなどなど。皮膚幹細胞は長期的な組織修復機能として自己複製と分化能力を有しているのでその力は皮膚の老化にとって大きな意義を持っている。しかし、今回の論文、数は減少するものの、老化しても幹細胞の性質やポテンシャルは維持されており、いわば若いまま維持されている。その幹細胞が老化しても若い頃同様にスタンバイできているのに対して、周囲の真皮細胞から形成される細胞外マトリックスからなる微小環境(本文中ニッチと呼んでいる)からのシグナルがその機能を決定する重要な組織であるという。
ちょっと端折っていうならば細胞外マトリックスECM成分の老化が幹細胞ひいては皮膚や毛包の老化の原因の一つという言い方もできる。
カクテル 45
ホワイトアレキサンダー white alexander
モーツアルト・ホワイトチョコレートリリキュールとウォッカを同量混ぜてシェイクする。チョコレートリリキュールはそのまま飲んでも美味しいけど案外なところでウォッカとも相性が良いことに気づきます。
お好みでウォッカをブランデーに変えても美味しい（写真はブランデーバージョン）。
ウォッカ 30ml
ホワイトチョコレートリリキュール 30ml
シェイクして注ぐ。
色味からだけでは想像できないようなチョコ味のお酒。甘くて上品。
簡単だし食後にピッタリ。
寒い冬にもリピートしたくなるような一杯。
September In the Rain🎵
Roy Hargrove
