オズコープの科学者であるリチャード・パーカー（演：キャンベル・スコット）は失踪理由をビデオメッセージに記録する。リチャードと妻のメアリー（演：エンベス・デイヴィッツ）が乗ったプライベートジェットは暗殺者にハイジャックされ飛行機は墜落し、リチャードとメアリーは死んでしまう。リチャードの息子であるピーター・パーカー（演：アンドリュー・ガーフィールド）はスパイダーマンとしてニューヨークの犯罪と戦い続けていた。スパイダーマンはトラックで暴走するアレクセイ・シツェビッチ（演：ポール・ジアマッティ）を逮捕し、そのまま恋人グウェン・ステイシー（演：エマ・ストーン）が待つ高校の卒業式へ向かう。ピーターは彼女の亡き父ジョージと交わした「彼女を危険に巻き込まないために別れる」という約束を果たせず苦しんでいた。その頃、ピーターの旧友ハリー・オズボーン（演：デイン・デハーン）がマンハッタンに戻ってくる。ハリーはオズコープのCEOノーマン・オズボーンの息子であり、父の死後、ハリーはオズコープの新CEOに就任する。オズコープで働くマックス・ディロン（演：ジェイミー・フォックス）は、街の送電システムを設計した優秀な電気技師だったが、その冴えない風貌と性格から誰からも好かれず、自身の命を助けてくれたスパイダーマンに異常な執着を見せていた。ある夜、彼は作業中の事故で電気人間（エレクトロ）になってしまい、その力をコントロールできずタイムズスクエアを停電させ破壊してしまう。これを止めに来たスパイダーマンに名前を覚えられていなかったことや、自分とは違い人々から愛されている姿に嫉妬しさらに暴走するが、エレクトロは捕縛され、カフカ博士（演：マートン・チョーカシュ）がいるレイブンクロフト刑務所へ収容される。ディロンは自らエレクトロと名乗りスパイダーマンの命を狙うようになってしまう。一方、ハリーは父ノーマンと同様に不治の病に侵されており、その症状が現れ始めていた。ハリーは父ノーマンが残した過去の研究データから、治療するにはスパイダーマンの血液が必要だという結論に達する。しかしピーターはコナーズ博士の経緯から輸血の影響を危険と考え、スパイダーマンとしても血液の提供を拒否する。これによりハリーはスパイダーマンに強い憎しみを抱くようになる。オズコープ副社長のドナルド・メンケンを含む役員達はエレクトロがディロンであることを隠蔽し、ハリーをCEOから失脚させ、オズコープを支配しようとしていた。ハリーはCEO補佐に任命されたフェリシア・ハーディから助けになる「装置」の存在を教えられ、エレクトロをオズコープへ連れ戻す。その「装置」とはノーマンが作り出した様々な兵器だった。ハリーはグリーン・ゴブリンになり、エレクトロと共謀してスパイダーマンの抹殺に動き出す。ピーターは父リチャードが残した情報から破棄された地下鉄の隠し研究室を突き止め、そこに残されていたビデオメッセージから失踪した理由を知る。その直後エレクトロが再び街中の電気を吸い取り、ニューヨーク一帯を停電させてしまう。スパイダーマンとグウェンは協力して発電所を再起動させ過電流を浴びせてエレクトロを倒す。安堵するのも束の間グリーン・ゴブリンが現れる。連れ去られたグウェンは時計塔の頂上から突き落とされ、スパイダーマンが間一髪で掴み取ったものの、頭を打ち付け即死する。ピーターはグウェンの死のショックから自警活動を止めてしまう。アレクセイ・シツェビッチは脱獄し、ノーマンが作り出した兵器を身に着けライノとして暴れ出す。ピーターはグウェンの卒業スピーチで自信を取り戻し、スパイダーマンとして再びライノの前に現れ、これからもニューヨークの平和を守り続ける事を改めて決意する。
