mRNワクチンの生産時に多くの不純物が精製されずに残っている

mRNワクチンの生産には、プラスミドDNA（pDNA）鋳型から始まり、続いてそれが直鎖化されてRNAに転写させて生産していきます。

詳しくは、メルク社のmRNAワクチン・mRNA治療薬の製造戦略などをご覧ください。

mRNワクチンの生産で除去が必要な不純物は、プラスミドDNA（pDNA）鋳型の精製（制限酵素、ウシ血清アルブミン（BSA）、DNA断片、エンドトキシンなどの不純物の除去）も必要になりますが、できたmRNAの精製も重要になります。

『in vitro転写ステップ後、不純物およびエンドトキシン、免疫原性のある二本鎖 RNA（dsRNA）、残存する鋳型DNA、RNA ポリメラーゼ、元素不純物などを含有する前工程で使用した材料からmRNAを精製します。この段階では、mRNAは、TFF、酵素によるキャップ付加、および／またはクロマトグラフィーステップに適したバッファーに溶解されている必要があります。mRNAの精製および残留DNAの除去にはいくつかの選択肢があります：

タンジェンシャルフローフィルトレーション（TFF） は、膜に保持されない小さな不純物からmRNAを効率的に分離するために使用されます。通常、鋳型DNAは、DNaseの添加によって分解されます。その結果得られる小さなDNA断片は、TFFを用いて大きなmRNA分子から容易に分離できます。mRNA のサイズに基づいて、30～300 kDaの分子量カットオフを使用することができます。TFFを使用すると、同じ操作で対象物質の精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。しかし、小さなDNA断片がmRNAとハイブリダイズして、新たな不純物を生成する可能性があり、これは鋳型DNAを除去するキャプチャーを使用すれば回避できます。3 

クロマトグラフィー技術、例えば逆相イオン対（IPRP）クロマトグラフィー、陰イオン交換（AEX）クロマトグラフィー、poly(dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィー（AC）など（図3）は、鋳型DNAを効率的に除去する手段を提供することで、鋳型DNA消化の必要性や、限外ろ過／ダイアフィルトレーションのステップでハイブリダイゼーションが発生するリスクを排除します。1 クロマトグラフィーは、酵素によるキャップ付加のステップ後にも、不要な生成物やオリゴヌクレオチド不純物を除去するために使用されます。しかし、クロマトグラフィーは高コストであり、メディア（充填剤）交換や後続ステップの前処理として、やはりTFFが必要となります。
逆相イオン対クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるmRNA精製の比較（DBC：動的結合容量）^4,5
図3.逆相イオン対クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるmRNA精製の比較（DBC：動的結合容量）4,5

逆相イオン対クロマトグラフィー（IPRP）は、一般に小規模生産に使用されます。この手法は、極めて効率的かつ迅速にRNAを精製でき、DNA、二本鎖RNA（dsRNA）および短い転写産物から一本鎖RNA（ssRNA）を良好に分離できます。この方法の欠点としては、溶媒を使用するためGMP製造設備での生産に向いていないこと、イオン対試薬によりmRNAとの複合体が形成されるためその除去にダイアフィルトレーションが必要となること、タンパク質や凝集体によるファウリングが生じやすいためキャプチャーよりポリッシングに向いていること、などが挙げられます。

陰イオン交換クロマトグラフィー（AEX）は、動的結合容量が大きく（10 mg RNA/mL以上）、免疫原性のある不純物（dsRNA、キャップ付加されていないRNA、RNA-DNAハイブリッド、その他のヘアピンmRNAなどのRNA構造など）を極めて高い効率で除去できます。AEXでは水溶液を使用できますが、レジンに結合した高分子量のmRNAを脱着させるために、毒性を発揮する可能性のあるカオトロピック剤の使用や最高85°Cまでの昇温が必要となる場合があります。常温で溶出するのは通常、500塩基未満のmRNAです。5

アフィニティークロマトグラフィー（AC） poly (dT)をキャプチャー用分子として用いるアフィニティークロマトグラフィーには、完全長mRNA転写産物のポリ (A) 鎖を特異的にキャプチャーするレジンを使用します。このプロセスにより、DNA、ヌクレオチド、酵素、バッファー成分およびポリ(A) 鎖を持たないその他のあらゆる不純物が効率的に除去されます。AEXと同様、水溶液を使用することができ、ACの場合、一般に塩濃度勾配が使用されます。IPRPやAEXとは異なり、ACではdsRNAとssRNAを区別できず、mRNAにハイブリダイズしたDNA断片などのその他の生成物に関連する不純物の除去に対して効果的ではありません。このため、一般的なアプローチとしては、最初のクロマトグラフィーステップはACですが、それに続いて、ポリッシングのためにAEXが使用されます。

最終濃縮とダイアフィルトレーション は、クロマトグラフィーの各ステップに続いて実行して、製剤純度を最大限に高めて、製剤用または保存用の適切なバッファーにmRNAを移します。この段階では、同じ操作でmRNAの精製、濃縮およびダイアフィルトレーションが可能です。このTFFステップの後に滅菌ろ過を実行できます。ただし、注意すべき点として、分子量が5000 kDa以上のmRNAについては、滅菌グレードでろ過することが難しい場合があります。

Bancel S, Issa J, Aunins J, Chakraborty T. 2014. Manufacturing methods for production of rna transcripts (Patent No. WO2014152027A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014152027A1/en
4.
Issa J, Barberio J, Aunins J, Aefyan N. Ion exchange purification of mRNA (Patent No. WO2014144767A1).. [Internet]. Available from: https://patents.google.com/patent/WO2014144767A1/en
5.
Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J, Shi Y, Sadtler K, Gao W, Lin J, et al. 2019. Delivery of mRNA vaccines with heterocyclic lipids increases anti-tumor efficacy by STING-mediated immune cell activation. Nat Biotechnol. 37(10):1174-1185. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0247-3

』

つまりあなたが注射されたコロナワクチンにどれだけの不純物が含まれていたか、今となってはわからないかもしれません。しかも何回もワクチン接種されていれば、いつどんな不純物が悪さしていてもわからないはずです。ワクチン接種する場合は接種前後の体調変化をしっかりと記録しておく必要があります。体調に明らかに変化があればわかりますが、精神的な変化はわかりにくいかもしれません。

⇒　ｍRNAワクチンなのに、なぜDNAが紛れ込んでいるのか？

 

急性黄斑神経網膜症（AMN）

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　急性黄斑神経網膜症（AMN）は、1975年に初めて報告され（BosとDeutmanにより）、若い女性によく見られるまれな網膜疾患で、外網膜血管の変化により一時的または永続的な中心視力喪失を引き起こします。中心傍暗点と最高矯正視力の低下が主な症状です。診断は主に光干渉断層撮影（OCT）画像で見られる構造的所見に基づいて行われます。

AMN 患者は、突然 1 つ以上の傍中心暗点、視力低下、および/または視力低下を訴えます。臨床的には、網膜内の赤褐色のくさび形の病変が中心窩の周囲に見られます。暗点は一般に無期限に持続しますが、数か月かけて部分的に解消するものもあります。大多数の患者では中心窩は影響を受けませんが、これまでの研究では中心窩出血、中心窩顆粒、異常な中心窩反射などの中心窩障害がみられる患者がいます。

2016年に発表されたレビュー記事では、AMN患者101人の156眼を対象とした最大規模のシリーズが特定されました。この研究の症例のほとんどは、20代前半の若い白人女性で報告されました。片側性症例と両側性症例の数はほぼ同じでしたが、両側性AMN（101人中55人、54.4%）の割合は、片側性AMN（101人中45人、44.5%）と比較してわずかに高くなりました。

最近、COVIDワクチン接種後にAMNを発症した症例がいくつか報告されています。Fekari氏と共著者らは2023年に発表した文献レビューで、そのような症例を21件特定し、そのうち20件（95%）が女性で、67%が経口避妊薬を服用していました。患者の大多数（90%）はワクチン接種後8日以内に視覚症状を経験しました。

網膜の深部毛細血管叢の血管障害が、この疾患の患者に見られる視力喪失につながることを示唆する証拠がある。自己免疫疾患における全身性炎症に関する別の理論が提唱されており、微小血栓症が小血管閉塞を引き起こし、虚血性網膜症につながる。この微小血栓症の理論は、COVID-19ワクチン接種および感染のいくつかの症例でも観察されている。

　【症状】

　中心傍暗点と最高矯正視力の低下。

＜出典：https://eyewiki.aao.org/Acute_Macular_Neuroretinopathy＞

　⇒　目の症状と病気

　⇒　コロナワクチンと目の疾患

コロナワクチンを多数回接種してなんともなかった人は超ラッキー

コロナワクチンにしろ、スパイクタンパクが脳に大きく影響を与えるとなると、今後認知症をはじめとした精神疾患、神経疾患が増える可能性があります。

ショッキングなドイツの研究論文があり、スパイクタンパク質は、骨髄から血管から本体まで「脳のあらゆる部位から検出され」それらは一様に脳組織を破壊していたそうです。

SARS-CoV-2 Spike Protein Accumulation in the Skull-Meninges-Brain Axis: Potential Implications for Long-Term Neurological Complications in post-COVID-19

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.04.04.535604v1

テキトーな工場で作ったワクチンで、テキトーな温度管理をやっているテキトーな会場で打った人はラッキーなのです。しかも多数回もワクチンを接種しても脳に影響がなかった人は超ラッキーなのです。

古い動画で申し訳ないのですが、ワクチンのロット間でもロット内でも成分の濃度が異なっています。

https://www.nicovideo.jp/watch/sm41496675

【ワクチン接種後に副作用が出る人と出ない人がいるのですか？
ワクチンのロットごとに濃度が異なります。

ワクチンの小瓶が冷凍保存されていなかった場合、mRNAの分解が起こりました。
脂質物質はペースト状になり、mRNAが分解します。

脂質ナノ粒子、ポリエチレングリコール及びmRNAを混ぜる時、
急速に混ぜてはいけない。
そうならないため、最初の数千本には非常に希薄な液体が充填され、
ロットの最後には非常に高濃度の脂質mRNAが残ります。

その結果、ワクチンの効果は千差万別となります。

その他製造工程の粗雑さが多数の不純物を含んでいる】

⇒　コロナワクチンの不純物に注意

⇒　新型コロナワクチン、ロット別死亡者数（修正）

 

 

 

Valsalva 網膜症

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　バルサルバ網膜症とは、バルサルバ効果に伴ってまれに生じる出血性網膜症です。バルサルバ効果とは、息を止めていきむことにより筋肉が緊張し、いつもより重たいものをもてたり、血圧が上昇して心拍が早まることをいいます。一方で、いきむことにより胸腔内圧が急激に上昇するため静脈血が胸腔内へ還流できなくなり静脈圧が急激に上がります。その結果、網膜血管が破綻して出血するのがバルサルバ網膜症の原因となっています。

　バルサルバ網膜症の経過は良好なことが多く、ほとんどのケースでは安静にして経過観察をするだけで後遺症もなく回復します。今回の患者さんの場合も入院して安静を保った結果、一週間後には視力も1.0まで回復しました。原因としていきみがあったかどうかはっきりしませんでしたが、咳きや嘔吐などで発症する場合もあるようです。

バルサルバ網膜症は、激しい身体活動による網膜血管の破裂によって引き起こされる網膜下出血、硝子体下出血、または内限界出血の一種です。重量挙げ、有酸素運動、咳、くしゃみ、いきみ、嘔吐、性交、妊娠、喘息、風船を膨らませる、楽器を爆破する、心肺蘇生法、褥瘡などの身体活動は、胸腔内圧や腹腔内圧の突然の上昇を引き起こす可能性があります。網膜表在血管の破裂を引き起こす可能性があります。胸腔内または腹腔内の圧力による静脈圧の急激な上昇により、網膜の中心窩の周囲の小さな毛細血管が破裂し、さまざまな強度の黄斑前出血を引き起こします。

　【症状】

　バルサルバ網膜症の主な症状は、突然の痛みのない視力喪失です。その他の症状には、飛蚊症の突然の発症、中心または中心傍の視野欠損、眼圧上昇による吐き気などがあります。

　【治療】

　バルサルバ網膜症は、出血の場所と程度に応じて、通常、数週間から数か月以内に合併症を起こすことなく治癒します。患者には、抗凝固薬の使用や、胸腔内圧または腹腔内圧を上昇させる身体活動を避けることが推奨されます。迅速な回復のためには、Nd:YAG レーザーまたはアルゴンレーザー椎弓切開術が推奨される場合があります。

＜出典：＞

　⇒　目の症状と病気

ファイザーのCOVID-19ワクチンに大量の残留DNAが存在する

フランスの科学者ディディエ・ラウル博士がついに
「ファイザーのCOVID-19ワクチンに大量の残留DNAが存在することを確認した」という内容のプレプリントを発表したそうです。

Confirmation of the presence of vaccine DNA in the Pfizer anti-COVID-19 vaccine
Didier Raoult (1, 2)

【メッセンジャーRNA（mRNA）ベースのワクチンの迅速製造は、COVID-19パンデミックと闘うための最も適した戦略として選択された。3件の研究で、ファイザー社のmRNAワクチンにはかなりの量のDNAが含まれていることが報告されている。我々はこの残存DNAの存在を確認することを目的とした。Qubit蛍光光度計を用いてワクチン・プラスミドDNAをワクチン・バイアルで定量したところ、平均216ng/投与量であり、Triton-X-100で処理した後は約24倍の平均5,160ng/投与量に達した。さらに、次世代シークエンシングにより、プラスミドDNAワクチンマトリックス（7,824塩基対）の全塩基配列を、高いカバレッジ（98.3％）とシークエンシング深度（平均、4,181-4,389リード）で取得し、プラスミドDNAが高いコピー数で存在することを示した。これらの結果から、mRNAワクチンに含まれるDNAのコピー数や性質について、より大規模かつ複数のバッチで、特に細胞内への送達後にDNAが統合されるリスクについて評価することが求められる。】

Qubit蛍光光度計は、標的分子にきわめて特異的に結合するさまざまなQubitアッセイ中の蛍光色素を検出することにより、これらの標的を定量します。測定は正確、高精度、かつ高感度であり、そのプロセスは迅速かつ簡単にそくていできるそうです。 

⇒　ｍRNAワクチンなのに、なぜDNAが紛れ込んでいるのか？