生化実習まとめ（構造式は各自で）
１．マイクロピペット
マイクロピペットは血清の採取を目的に作られたもので、これと粘度の違う試料を正確に測定することは出来ない。また、チップや本体はプラスチックなので、これを侵食する恐れのある有機溶媒の採取に用いてはならない。マイクロピペットには採取可能な容量が定められており、この容量を超えて採取を行ってはならず、また、この容量の１/１０未満の採取を行ってはならない。つまり、
１０００μｌのマイクロピペットならば、１００～１０００μｌの採取が可能である。その他、基本的にはプッシュボタンのストロークが長い方が正確に試料を採取することが可能である。
２．血糖値の測定
血糖値とはグルコースのことであり、検査の意義は糖尿病の診断である。この診断には明確な基準値が設けられており、１２６ｍｇ/ｄｌ以上で糖尿病、さらに、１１０ｍｇ/ｄｌ以上で糖尿病予備軍となる。臨床の検査では、酵素反応による測定が行われる。これは基質特異性を利用したものであり、具体的には、グルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）と呼ばれる。グルコースと水がＧＯＤにより、グルコン酸とＨ２Ｏ２に分解され、このＨ２Ｏ２と、４－アミノアンチピリン、フェノール（またはＤＡＯＳ）と共にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で反応させると、グルコースのｍｏｌ数に比例した赤色（ＤＡＯＳの場合は青色）キノンを産生するので、これを、５０５ｎｍにて測定する。なお血糖測定用採血管にフッ化Ｎａが加えられている。
３．蛋白
蛋白は多数のアミノ酸がペプチド結合した、固有の等電点を持つ両性荷電物質である。生体においては体構成成分としての役割を持ち、血中にはＡｌｂやＧｌｂとして、７ｍｇ/ｄｌ含まれている。血中総蛋白（ＴＰ）はビウレット法を用いて検査する。アルカリ性下においてＴＰは銅イオンとキレート結合して錯体を形成し、その結果、青紫色を呈する。これを５４０ｎｍにて比色する。また、ＡｌｂはＢＣＧ法で測定を行う。Ａｌｂ発色試薬（ｐＨ４．２）に血清を添加すると、Ａｌｂは試薬中のブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）とキレート結合し、青色を呈する。これを６３０ｎｍにて比色する。これらの方法よってＴＰ・Ａｌｂを求めたならば、ＴＰ量－Ａｌｂ量からＧｌｂ量を求めることが出来、さらにＡ/Ｇ比を求めることも可能である。
４．電気泳動
血中蛋白は電気泳動を用いても測定が可能である。蛋白は両性荷電物質であるので、アルカリ性下においては、陰性に荷電する。陰性に荷電した蛋白は陰極から陽極へと移動し、その距離は陰性度が強い（Ａｌｂなど）ほど長くなる。具体的には支持体であるセルロースアセテート膜に蛋白を塗布し、ｐＨ８．６のベロナール緩衝液を使って、電気泳動を行う。この時、塗布した蛋白が黄色に見えるのは、間接ビリルビンによるものである。その後、ポンソー３Ｒを使って染色した後、低濃度酢酸で脱色し、デカリンにて透明化を行い、デンシトメーターにかける。
電気泳動でも定量と同様、Ａ/Ｇ比を求めることが出来るが、両者の間には若干の差（泳動＞定量）がある。これはＡｌｂがＧｌｂに比較して、色素吸着能（親和性）が高いことが原因で、これによりＡｌｂは本来の値より高い値を示す為、相対的にＡ/Ｇ比も高値を示すのである。
５．アミノ酸の構造式
６．脂質
脂質は水に不溶である。これは脂質が親水性基を全く持たないか、持っていても疎水性基の数が上回っている事に起因しており、前者にはＴＧやコレステロールエステル（Ｅ－ｃｈｏ）が該当し、後者には遊離コレステロール（Ｆ－ｃｈｏ）やリン脂質（ＰＬ）が該当する。
７．ＴＧ
ＴＧとはトリアシルグリセロールの略称であり、これはグリセリンに３分子の脂肪酸（ＦＡ）がエステル結合したものの総称でもある。血中のＴＧを測定する場合の注意事項として、ＴＧは全てグリセリンに３分子のオレイン酸がエステル結合したトリオレインとして測定するというルールがある。
ＴＧをＬＰＬ（リポプロテインリパーゼ）の作用で加水分解すると、グリセリンとＦＡに分解される。遊離したグリセリンはＡＴＰの存在下でＧＫ（グリセリンキナーゼ）によってグリセリン－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）になる。このＧ３ＰにＧＰＯ（Ｇ３Ｐオキシダーゼ）を作用させると、Ｇ３Ｐは酸化され同時に定量的に過酸化水素が生成される。生じた過酸化水素はＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）の作用により、４－アミノアンチピリンとＰ－クロルフェノールとを酸化縮合させて赤色色素を生成。６００ｎｍで比色する。
８．総コレステロール（Ｔ－ｃｈｏ）
Ｔ－ｃｈｏとはＦ－ｃｈｏとＥ－ｃｈｏの総和であり、測定にはこの原理が利用される。血清中のＥ－ｃｈｏ類をコレステロールエステラーゼでＦ－ｃｈｏとＦＡに分解する。生成したＦ－ｃｈｏと血清中のＦ－ｃｈｏはＣＯＤ（コレステロールオキシダーゼ）によって酸化され同時に過酸化水素を生成する。この過酸化水素はＰＯＤの作用でＤＡＯＳ・４－アミノアンチピリンと定量的に酸化縮合して青色色素を産生する。これを６００ｎｍで比色する。
９．ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－ｃｈｏ）
ＣＭ・ＶＬＤＬ・ＨＤＬ・ＬＤＬといったリポ蛋白はＡ・Ｂ・Ｃ・Ｅのアポ蛋白をそれぞれ持っている。アポ蛋白の構成はリポ蛋白によって違いがあり（以下の表）、この違いからＨＤＬのみを遠心分離することが可能である。
A B C E
CM + + + +
VLDL - + + +
HDL + - + +
LDL - + - -
表からも分かるようにＨＤＬはリポ蛋白の内、唯一アポ蛋白Ｂを持たない。そこで血清にアポ蛋白Ｂ共沈剤（リンタングステン酸＋マグネシウムイオン、またはヘパリン＋マンガンイオン）を加えて遠心することで、上清にＨＤＬだけが分離されることになる。こうして得られたＨＤＬに発色試薬を加えると、Ｔ－ｃｈｏの場合と同様の反応が起こり、青色色素が産生される。これを比色定量する。
１０．ＬＤＬ－ｃｈｏ
Ｔ－ｃｈｏはＦ－ｃｈｏとＥ－ｃｈｏの総和であると同時に、ＣＭ－ｃｈｏ、ＶＬＤＬ－ｃｈｏ、ＨＤＬ－ｃｈｏ、
ＬＤＬ－ｃｈｏの総和でもある。これらの内、ＣＭ－ｃｈｏ、ＶＬＤＬ－ｃｈｏの量はＣＭ、ＶＬＤＬに含まれるＴＧのおよそ１/５程度であり、ＨＤＬやＬＤＬにはほぼ含有されていない。以上の条件からＬＤＬ－ｃｈｏは以下の式で算定することが出来る。
ＬＤＬ－ｃｈｏ＝（Ｔ－ｃｈｏ）－（ＨＤＬ－ｃｈｏ）－ＴＧ/５
１１．コレステロールの構造式
１２．ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）
ＬＤＨは乳酸が酸化されてピルビン酸に変化する反応およびその逆向きの反応を触媒する。乳酸→ピルビン酸の反応では、ＮＡＤが還元され、ＮＡＤＨとＨ（＋）が生成する。この反応は弱アルカリ下での反応であり、Ｈ（＋）が生成されることで、ｐＨは低下し、反応が進行するほど反応速度は低下する。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度の増加はＬＤＨ活性に比例する。
１３．乳酸とピルビン酸の構造式
１４．ＡＬＰ（アルカリ性ホスファターゼ）
血清中のＡＬＰはフェニルリン酸を、フェノールとリン酸とに分解する。生成されたフェノールはフェロシアン化Ｋの働きで、アルカリ下において４－アミノアンチピリンと反応して、赤色色素を生成する。この色素を５００ｎｍで比色する。実際の試験では、基質濃度を変化させて、反応速度を求め、ラインウェーバーのグラフから、ミカエリス定数・最大反応速度を求める。
１５．以下のデータから正確度と精密度の評価
１回目 ２回目 ３回目 ４回目 ５回目 ６回目
ＳｐⅠ 291.3 272.6 291.3 286.6 278 286.6
ＳｐⅡ 546.6 493.3 513.3 485.3 458 563.3
１班 ２班 ３班 ４班 ５班 ６班
ＳｐⅠ 281 206 322 272 286 284
ＳｐⅡ 495 329 561 536 505 510
・正確
下のデータの各班のデータを平均する。このとき最高値と最低値を除くと良い。
平均値→ＳｐⅠ２８１ ＳｐⅡ５１２
次に自分の班のデータ（仮に６班とする）と平均値との乖離度を求める。
乖離度＝（（自分のデータ）－（平均値））/平均値×１００
ＳｐⅠ１．１％ ＳｐⅡ０．４％
この程度の乖離度ならかなり正確といえる。
・精密
上のデータからＳｐⅠ・Ⅱの平均値・ＳＤ・ＣＶを求める。
ＣＶ＝ＳＤ/平均×１００
ＳｐⅠ２．６％ ＳｐⅡ７．７％
これをＴｏｎｋｓと比較（この実習で測定した物質はすべてＴｏｎｋｓ＝５％）。
ＴｏｎｋｓよりＣＶが低ければ精密。
１６．以下のデータからラインウェーバーのグラフを描き、最大反応速度を求めよ
吸光度 基質濃度[s]（mM） 1/[s]
Std 0.837 5.00
Sp1 0.159 0.25 4.00
Sp2 0.243 0.50 2.00
Sp3 0.307 1.00 1.00
Sp4 0.455 2.50 0.40
Sp5 0.537 5.00 0.20
Sp6 0.537 7.50 0.13
※５０Ｋ-Ａとする
まず（Ｓｐの吸光度/Ｓｔｄの吸光度）×５０（Ｋ-Ａ）から反応速度を求める。
Ｓｐ１から順に９．５ １４．５ １８．３ ２７．２ ３２．１ ３２．１
これの逆数（１/Ｖ）を取る。
順に１０５ ６８．９ ５４．５ ３６．８ ３１．２ ３１．２（全て×１０の３乗）
縦軸に１/Ｖ、横軸に１/Ｓを取ってグラフ作成。
縦軸と交わる点を１/Ｖｍａｘ 横軸と交わる点を－１/Ｋｍとする。
それぞれの逆数を求め、Ｖｍａｘ Ｖｍａｘ/２ Ｋｍを求める。
1/Vmax＝２．９×１０－３
Vmax＝３４．５
Vmax/２＝１７．２５
－１/Km＝－１．１５
Km＝０．８７０
大体こんな感じ。
１．マイクロピペット
マイクロピペットは血清の採取を目的に作られたもので、これと粘度の違う試料を正確に測定することは出来ない。また、チップや本体はプラスチックなので、これを侵食する恐れのある有機溶媒の採取に用いてはならない。マイクロピペットには採取可能な容量が定められており、この容量を超えて採取を行ってはならず、また、この容量の１/１０未満の採取を行ってはならない。つまり、
１０００μｌのマイクロピペットならば、１００～１０００μｌの採取が可能である。その他、基本的にはプッシュボタンのストロークが長い方が正確に試料を採取することが可能である。
２．血糖値の測定
血糖値とはグルコースのことであり、検査の意義は糖尿病の診断である。この診断には明確な基準値が設けられており、１２６ｍｇ/ｄｌ以上で糖尿病、さらに、１１０ｍｇ/ｄｌ以上で糖尿病予備軍となる。臨床の検査では、酵素反応による測定が行われる。これは基質特異性を利用したものであり、具体的には、グルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）と呼ばれる。グルコースと水がＧＯＤにより、グルコン酸とＨ２Ｏ２に分解され、このＨ２Ｏ２と、４－アミノアンチピリン、フェノール（またはＤＡＯＳ）と共にペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で反応させると、グルコースのｍｏｌ数に比例した赤色（ＤＡＯＳの場合は青色）キノンを産生するので、これを、５０５ｎｍにて測定する。なお血糖測定用採血管にフッ化Ｎａが加えられている。
３．蛋白
蛋白は多数のアミノ酸がペプチド結合した、固有の等電点を持つ両性荷電物質である。生体においては体構成成分としての役割を持ち、血中にはＡｌｂやＧｌｂとして、７ｍｇ/ｄｌ含まれている。血中総蛋白（ＴＰ）はビウレット法を用いて検査する。アルカリ性下においてＴＰは銅イオンとキレート結合して錯体を形成し、その結果、青紫色を呈する。これを５４０ｎｍにて比色する。また、ＡｌｂはＢＣＧ法で測定を行う。Ａｌｂ発色試薬（ｐＨ４．２）に血清を添加すると、Ａｌｂは試薬中のブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）とキレート結合し、青色を呈する。これを６３０ｎｍにて比色する。これらの方法よってＴＰ・Ａｌｂを求めたならば、ＴＰ量－Ａｌｂ量からＧｌｂ量を求めることが出来、さらにＡ/Ｇ比を求めることも可能である。
４．電気泳動
血中蛋白は電気泳動を用いても測定が可能である。蛋白は両性荷電物質であるので、アルカリ性下においては、陰性に荷電する。陰性に荷電した蛋白は陰極から陽極へと移動し、その距離は陰性度が強い（Ａｌｂなど）ほど長くなる。具体的には支持体であるセルロースアセテート膜に蛋白を塗布し、ｐＨ８．６のベロナール緩衝液を使って、電気泳動を行う。この時、塗布した蛋白が黄色に見えるのは、間接ビリルビンによるものである。その後、ポンソー３Ｒを使って染色した後、低濃度酢酸で脱色し、デカリンにて透明化を行い、デンシトメーターにかける。
電気泳動でも定量と同様、Ａ/Ｇ比を求めることが出来るが、両者の間には若干の差（泳動＞定量）がある。これはＡｌｂがＧｌｂに比較して、色素吸着能（親和性）が高いことが原因で、これによりＡｌｂは本来の値より高い値を示す為、相対的にＡ/Ｇ比も高値を示すのである。
５．アミノ酸の構造式
６．脂質
脂質は水に不溶である。これは脂質が親水性基を全く持たないか、持っていても疎水性基の数が上回っている事に起因しており、前者にはＴＧやコレステロールエステル（Ｅ－ｃｈｏ）が該当し、後者には遊離コレステロール（Ｆ－ｃｈｏ）やリン脂質（ＰＬ）が該当する。
７．ＴＧ
ＴＧとはトリアシルグリセロールの略称であり、これはグリセリンに３分子の脂肪酸（ＦＡ）がエステル結合したものの総称でもある。血中のＴＧを測定する場合の注意事項として、ＴＧは全てグリセリンに３分子のオレイン酸がエステル結合したトリオレインとして測定するというルールがある。
ＴＧをＬＰＬ（リポプロテインリパーゼ）の作用で加水分解すると、グリセリンとＦＡに分解される。遊離したグリセリンはＡＴＰの存在下でＧＫ（グリセリンキナーゼ）によってグリセリン－３－リン酸（Ｇ３Ｐ）になる。このＧ３ＰにＧＰＯ（Ｇ３Ｐオキシダーゼ）を作用させると、Ｇ３Ｐは酸化され同時に定量的に過酸化水素が生成される。生じた過酸化水素はＰＯＤ（ペルオキシダーゼ）の作用により、４－アミノアンチピリンとＰ－クロルフェノールとを酸化縮合させて赤色色素を生成。６００ｎｍで比色する。
８．総コレステロール（Ｔ－ｃｈｏ）
Ｔ－ｃｈｏとはＦ－ｃｈｏとＥ－ｃｈｏの総和であり、測定にはこの原理が利用される。血清中のＥ－ｃｈｏ類をコレステロールエステラーゼでＦ－ｃｈｏとＦＡに分解する。生成したＦ－ｃｈｏと血清中のＦ－ｃｈｏはＣＯＤ（コレステロールオキシダーゼ）によって酸化され同時に過酸化水素を生成する。この過酸化水素はＰＯＤの作用でＤＡＯＳ・４－アミノアンチピリンと定量的に酸化縮合して青色色素を産生する。これを６００ｎｍで比色する。
９．ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－ｃｈｏ）
ＣＭ・ＶＬＤＬ・ＨＤＬ・ＬＤＬといったリポ蛋白はＡ・Ｂ・Ｃ・Ｅのアポ蛋白をそれぞれ持っている。アポ蛋白の構成はリポ蛋白によって違いがあり（以下の表）、この違いからＨＤＬのみを遠心分離することが可能である。
A B C E
CM + + + +
VLDL - + + +
HDL + - + +
LDL - + - -
表からも分かるようにＨＤＬはリポ蛋白の内、唯一アポ蛋白Ｂを持たない。そこで血清にアポ蛋白Ｂ共沈剤（リンタングステン酸＋マグネシウムイオン、またはヘパリン＋マンガンイオン）を加えて遠心することで、上清にＨＤＬだけが分離されることになる。こうして得られたＨＤＬに発色試薬を加えると、Ｔ－ｃｈｏの場合と同様の反応が起こり、青色色素が産生される。これを比色定量する。
１０．ＬＤＬ－ｃｈｏ
Ｔ－ｃｈｏはＦ－ｃｈｏとＥ－ｃｈｏの総和であると同時に、ＣＭ－ｃｈｏ、ＶＬＤＬ－ｃｈｏ、ＨＤＬ－ｃｈｏ、
ＬＤＬ－ｃｈｏの総和でもある。これらの内、ＣＭ－ｃｈｏ、ＶＬＤＬ－ｃｈｏの量はＣＭ、ＶＬＤＬに含まれるＴＧのおよそ１/５程度であり、ＨＤＬやＬＤＬにはほぼ含有されていない。以上の条件からＬＤＬ－ｃｈｏは以下の式で算定することが出来る。
ＬＤＬ－ｃｈｏ＝（Ｔ－ｃｈｏ）－（ＨＤＬ－ｃｈｏ）－ＴＧ/５
１１．コレステロールの構造式
１２．ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）
ＬＤＨは乳酸が酸化されてピルビン酸に変化する反応およびその逆向きの反応を触媒する。乳酸→ピルビン酸の反応では、ＮＡＤが還元され、ＮＡＤＨとＨ（＋）が生成する。この反応は弱アルカリ下での反応であり、Ｈ（＋）が生成されることで、ｐＨは低下し、反応が進行するほど反応速度は低下する。ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度の増加はＬＤＨ活性に比例する。
１３．乳酸とピルビン酸の構造式
１４．ＡＬＰ（アルカリ性ホスファターゼ）
血清中のＡＬＰはフェニルリン酸を、フェノールとリン酸とに分解する。生成されたフェノールはフェロシアン化Ｋの働きで、アルカリ下において４－アミノアンチピリンと反応して、赤色色素を生成する。この色素を５００ｎｍで比色する。実際の試験では、基質濃度を変化させて、反応速度を求め、ラインウェーバーのグラフから、ミカエリス定数・最大反応速度を求める。
１５．以下のデータから正確度と精密度の評価
１回目 ２回目 ３回目 ４回目 ５回目 ６回目
ＳｐⅠ 291.3 272.6 291.3 286.6 278 286.6
ＳｐⅡ 546.6 493.3 513.3 485.3 458 563.3
１班 ２班 ３班 ４班 ５班 ６班
ＳｐⅠ 281 206 322 272 286 284
ＳｐⅡ 495 329 561 536 505 510
・正確
下のデータの各班のデータを平均する。このとき最高値と最低値を除くと良い。
平均値→ＳｐⅠ２８１ ＳｐⅡ５１２
次に自分の班のデータ（仮に６班とする）と平均値との乖離度を求める。
乖離度＝（（自分のデータ）－（平均値））/平均値×１００
ＳｐⅠ１．１％ ＳｐⅡ０．４％
この程度の乖離度ならかなり正確といえる。
・精密
上のデータからＳｐⅠ・Ⅱの平均値・ＳＤ・ＣＶを求める。
ＣＶ＝ＳＤ/平均×１００
ＳｐⅠ２．６％ ＳｐⅡ７．７％
これをＴｏｎｋｓと比較（この実習で測定した物質はすべてＴｏｎｋｓ＝５％）。
ＴｏｎｋｓよりＣＶが低ければ精密。
１６．以下のデータからラインウェーバーのグラフを描き、最大反応速度を求めよ
吸光度 基質濃度[s]（mM） 1/[s]
Std 0.837 5.00
Sp1 0.159 0.25 4.00
Sp2 0.243 0.50 2.00
Sp3 0.307 1.00 1.00
Sp4 0.455 2.50 0.40
Sp5 0.537 5.00 0.20
Sp6 0.537 7.50 0.13
※５０Ｋ-Ａとする
まず（Ｓｐの吸光度/Ｓｔｄの吸光度）×５０（Ｋ-Ａ）から反応速度を求める。
Ｓｐ１から順に９．５ １４．５ １８．３ ２７．２ ３２．１ ３２．１
これの逆数（１/Ｖ）を取る。
順に１０５ ６８．９ ５４．５ ３６．８ ３１．２ ３１．２（全て×１０の３乗）
縦軸に１/Ｖ、横軸に１/Ｓを取ってグラフ作成。
縦軸と交わる点を１/Ｖｍａｘ 横軸と交わる点を－１/Ｋｍとする。
それぞれの逆数を求め、Ｖｍａｘ Ｖｍａｘ/２ Ｋｍを求める。
1/Vmax＝２．９×１０－３
Vmax＝３４．５
Vmax/２＝１７．２５
－１/Km＝－１．１５
Km＝０．８７０
大体こんな感じ。
