タンパク質の発現および精製プロトコル

タンパク質の機能と機能性タンパク質の産生の研究は、基本的にタンパク質の異種発現と精製と切り離せません。

本日は、タンパク質の発現と精製について、以下の観点からお話します。

 

1.ラベルの選択

 

現在一般的な発現タグは、Hisタグ（ヒスチジンタグ）、GSTタグ（グルタチオンスルフヒドリルトランスフェラーゼタグ）、MBPタグ（マルトース結合タンパク質タグ）、CBDタグ（キチン結合領域タグ）です。

各タグには、タグの分子量、タンパク質の溶解性を調節する能力、タンパク質の折り畳みへの影響、切除が必要かどうかなど、固有の特性があります。

精製したいタンパク質の特性に応じて、適切なラベルを選択してください。ラベルは適切に選択されており、その後の実験では半分の労力で2倍の結果が得られます。

2.ベクトル構築

 

使用するラベルを選択した後、発現ベクターを準備する必要があります。現在、Hisタグ付きのpET28シリーズやMBPタグ付きのpMALシリーズなど、多くの市販ベクターからお選びいただけます。

ほとんどのベクターシリーズには、N末端またはC末端にタグを挿入する形式が含まれており、タンパク質の特性に応じて柔軟に選択できます。

タンパク質コーディング遺伝子を挿入するときは、フレームシフトを避けるために注意を払う必要があります。ベクターを最初から作成したい場合は、適切なプロモーターと転写終結配列を挿入することを忘れないでください。プロモーター配列は一般に誘導性プロモーターを使用し、構成的プロモーターは外来タンパク質の時期尚早な発現および蓄積を引き起こし、これは宿主の増殖を助長しない。

 

3.ホストの選択

 

一般的な宿主は、大腸菌、哺乳類細胞、酵母、昆虫です。大腸菌の場合、異種発現に最も適した株はBL21とその派生株ですが、ベクターで選択された転写および翻訳要素に従って選択する必要があります。

 

BL21の内因性プロテアーゼ遺伝子が欠落しているため、外来タンパク質の発現に適した株ですが、T7 RNAポリメラーゼがないため、T7プロモーターを含むタンパク質の発現には使用できません。 BL21（DE3）、BL21ではT7ファージゲノムの統合に基づいており、pETシリーズなどのT7発現システムに適しています。 BL21（DE3）に基づくBL21（DE3）PLySsは、T7ポリメラーゼの発現をより厳密に制御できるT7リゾチーム遺伝子を持っています。

 

エンドヌクレアーゼ（endA1）リコンビナーゼ（recA1）などの遺伝子が存在するため、プラスミドはBL21シリーズの菌株ではそれほど安定しておらず、ゲノム、喪失、変異などに組み込まれている可能性があることに注意してください。したがって、優れたベクターを構築します。DH5αなどの株に保存する必要があります。

 

4.培養条件の最適化

 

大腸菌発現システムを例にとると、LB培地は蘇生と種子培養の両方に使用できます。

タンパク質の合成と蓄積を促進するために、TB培地など、発酵段階ではアミノ酸含有量は多いが糖源が少ない培地を使用することをお勧めします。

誘導性プロモーターを使用する場合は、細菌が対数増殖後期に増殖するときにIPTGなどの誘導物質を追加する必要があります。

インデューサーを加えた後、培養温度を16〜30℃に下げる必要があります。培養温度が低いほど、タンパク質の蓄積が遅くなり、封入体が生成される可能性が低くなります。

 

5.精製カラムの材料の選択

各ラベルには、対応する精製カラム材料があります。 GSTタグはグルタチオンゲルを使用し、MBPタグは多糖類樹脂を使用し、CBDタグはキチン樹脂を使用し、Hisタグは二価金属イオンと結合したフィラーを使用します。最も一般的なものはニッケルイオン（一般にニッケルカラムとして知られています）と結合しています。

NEBExpressニッケルカラムパッキング（S1428S）は、2019年11月に新たに発売されました。また、スクリーニング段階での小タンパク質精製により適した、プレパックされたスピンカラムフォーム（S1427S / L）もあります。 1mgのHis標識タンパク質の精製には15分しかかかりません。

1 mlのニッケルカラムパッキングごとに、10mg以上のヒスチジンタグタンパク質を精製できます。

Hisタグ付きタンパク質への非常に特異的な結合、分離および精製後の純度> 95％。

強力なニッケルイオン結合により、EDTAおよび還元剤に対して非常に耐性があり、一般的な界面活性剤ベースの細胞溶解試薬と互換性があります。