ノンRIのEMSAプロトコールです。
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)： ゲルシフトアッセイ
★基本的な仕組み
DNAとタンパク質の結合を見る。
★使い道
ある遺伝子のプロモーター領域に特定の転写因子が結合するかどうかをみる。
プロモーターアッセイと併用し、ある遺伝子発現制御が特定の転写因子によって制御されていることをいう場合につかう。
ある細胞への刺激で、特定のDNA配列へ結合する転写因子が核移行するかどうかをみる。
★原理
タンパク質-DNA複合体がフリーのDNA断片(あるいは2本鎖オリゴヌクレオチド)より非変性ポリアクリルアミドゲルにおける移動度がより小さいという泳動度の違いでDNAとタンパク質が複合体を形成しているかどうかをみます。
ゲルシフトアッセイは精製したタンパク質、またはタンパク質混合液(例えば核または細胞抽出液)を、タンパク質結合サイトと考えられる配列を含むDNA断片（プローブ）とインキュベートすることで行ないます。
このプローブオリゴヌクレオチドは末端をラベル（32PなどのRI標識や、DIG・Biotinなどのnon RI標識）されており、RIラベルの場合は直接フィルムを使いオートラジオグラフィーで、non RIラベルの場合は抗ジゴキシゲニン-ALP（DIGラベル）やストレプトアビジン-HRP（Biotinラベル）を用いて以下化学発光させ検出します。
結合サイトと思われる配列に対するDNA結合タンパク質の特異性は、
（１）試験するタンパク質への結合サイトを含むDNA断片またはオリゴヌクレオチドで、標識していないものを過剰量添加するコンペティション試験、
（２）サンプルタンパク質を増量することで濃度依存的にシフトしたバンドが濃くなることを確認
（３）標的タンパク質への特異的抗体を泳動前に反応させ、DNA-タンパク質-抗体複合体を形成させ、さらに移動度が小さくなるか（スーパーシフト）確認
（４）タンパク質結合サイトと考えられる配列を一部変異させたDNA配列を用いた場合に結合しない（シフトしない）ことを確認
することで見ることができます。
★必要な試薬
・TENバッファー
10 mM Tris（pH 8.0）
1 mM EDTA
0.1 mM NaCl
・TBE 10X buffer (1L)
107.80g Tris base
55g boric acid
7.44g disodium EDTA?2H2O
・10X Binding Buffer
100 mM Tris（pH 7.5）
500 mM KCl
10 mM DTT
★プロトコールフローチャートと各ステップのおおよその所要時間 （具体的な方法は後述）
１．オリゴヌクレオチドのラベリングとアニーリング （１０分）
２．オリゴヌクレオチド-タンパク複合体の形成（ゲルシフト反応 [Binding reaction]）（３０分）
３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１時間）
４．ブロッティングとクロスリンク(架橋)（４５分）
５．化学発光検出 （１時間）
★具体的な操作方法と注意点
０．非変性ポリアクリルアミドゲル（PAGEゲル）作成
EMSAを行う前日にキャストし、十分に重合させておく。
・４％PAGEゲル (20ml)
×１０TBE 1.0ml
30% (37.5:1)アクリルアミド：Bisアクリルアミド 2.8ml
40% アクリルアミド 125ul
80% グリセロール 625ul
蒸留水 15.5ml
10% APS 150ul
TEMED 10ul
ウェスタンブロットのゲルと違い、スタッキングゲルはありません。
ウェスタンブロットのゲルと同じく空気に触れているところは固まらないので、わたしはキャストしたらそのまま大きめの水槽に入れて、蒸留水（または脱イオン水）で水没させてます。
１．オリゴヌクレオチドのアニーリング
Biotinラベルの場合、PCRプライマー注文とほぼ同じで末端Biotinラベルにチェック。
逆相カートリッジカラム精製でオーダー。
結合サイトと思われる配列＋上下数ベースの２０～３０merでプローブ作製。（どれくらいのベースがいいかはまだわかりません。）
senseとanti-sense両方を注文し、それらをアニールする。
標識はsenseまたはanti-sense片側だけでもOK。
(1)注文した１本鎖オリゴヌクレオチドをTENバッファーに溶解。
(2)senseとanti-senseオリゴヌクレオチドの一部を等モル混合。
(3)94℃で10分間インキュベート。
(4)ゆっくりと室温まで冷却。（チューブをヒートブロックに入れたままそのままブロックごとテーブルに放置し、自然冷却）
(5)所定濃度に希釈（ラベル：20fmol/ul、アンラベル（ラベルの200倍）：4pmol/ul）
２．オリゴヌクレオチド-タンパク複合体の形成
タンパク質-DNA結合反応は結合用バッファーや温度に大きく影響されます。
* 精製されたDNA結合タンパクを用いる場合、非特異的な競合DNAを低濃度で使用するか、あるいは使用する必要はありません。
* クルードな抽出試料中のファクターを解析する場合、結合反応に非特異的な競合DNAを加えることが絶対に必要です。
* 結合反応によっては、異なる反応温度(4 ℃から37℃の範囲)が必要となることがあります。
* 塩濃度やpHがタンパクとDNAとの相互作用に影響することが知られています。
形成される複合体が特異的か非特異的かは、バッファーの条件に依存します。
したがって、Mg2+, Zn2+, Ca2+, 界面活性化剤やスペルミジンなどを追加で使用することも重要となることがあります。
過去の論文で同じ転写因子でEMSAしている論文があれば、それの条件を参考にする。
* poly-L-lysineは、特異的なタンパク/DNA複合体の形成を個々の反応において最適化させます。これは塩基性ペプチドがDNAとの親和性を高める可能性もあるからです。
アルブミンも同様に特異的なタンパク/DNA複合体の形成を良くするために用いる事が出来ます。
* プローブと核タンパクとを添加する順序が、形成されるタンパク-DNAの特異性を決定することがあります。
（通常は、poly (dI・dC)+タンパクサンプルを混ぜ何分か反応、その後プローブ添加しBinding reaction）
核タンパクサンプルを用いる場合、核タンパク抽出液は塩濃度が非常に高いため、反応系中でボリウムが増えすぎると持ち込む塩濃度が高くなりすぎるため、多くても系の1/10量にとどめておく方が無難。
(1)氷上で以下の内容物を混合（トータル量：20ul）
終濃度 量
ulrtapure water --- 10ul
10× Binding Buffer 1× 2ul
50% Glycerol 2.5% 1ul
100mM MgCl2 5mM 1ul
1ug/ul Poly(dI・dC) 50ng/ul 1ul
1% NP-40 0.05% 1ul
unlabeled probe 4pmol 1ul
タンパクサンプル 2ug 2ul
Biotin-label probe 20fmol 1ul
(2)室温でインキュベート。
３．PAGEゲル電気泳動（１時間）
（２）のBinding reactionを行っている間にあらかじめゲルのpre-runを行っておく。（0.5 × TBEバッファー、１００V、３０分～１時間）
SDSなどの界面活性剤が混入すると、複合体が分離されるため、western blotで使ったシステムを使う場合、特に念入りに洗ってから使う。
(1)ウェル洗浄
(2)それぞれの試料にブロモフェノールブルー（BPB）を含むローディングバッファーを 5ul添加。
(3)ウェルにアプライ（20ul）
(4)電気泳動（～100V、BPBがゲルの下部2/3～3/4程度まで泳動：BPBの付近にフリープローブが移動している）
(5)電気泳動中に次の転写準備
・ゲルと同じサイズに切ったナイロンメンブレンを、トランスファー用バッファー(0.5 × TBEバッファー)中で少なくとも１０分間平衡化
・ゲルと同サイズのワットマン3mm濾紙を４枚用意し、トランスファー用バッファーにつけておく。
・スポンジもトランスファー用バッファーにつけておく。
４．ブロッティングとクロスリンク(架橋)（４５分）
ここも（３）と同じく、western blotと共用する場合は洗浄を念入りに。（とくにスポンジ）
転写バッファーも0.5 × TBEバッファー。
クロスリンクはPCRゲル観察用のUVトランスイルミネーター上に転写したメンブレンをおいて１５分UV照射が簡単。
(1)電気泳動後、ゲルから片側ガラス板を注意深く取り外す。（スペーサーをこじるかんじで、ウェルの枠がこびりつきやすいので注意）
(2)タンク式の場合、下図のように積層し、気泡を抜く。
(3)380mA、30分転写（できるだけ低温で。ウェスタンブロットのウェット転写よりも電流変動はしにくい。）
(4)転写終了後、メンブレンの転写面を下にしてUVトランスイルミネーターで１５分UV照射。
５．化学発光検出
メンブレンは乾燥しないようにする。
注意点は、ウェスタンブロットのケミルミステップと同等。
(1)１５分ブロッキング
(2)ストレプトアビジン-HRPと反応させる（１５分）
(3)メンブレン洗浄（５分×４回）
(4)substrate equilibration buffer（Pierce社LightShift Chemiluminescent EMSA kitの場合）で５分。
(5)ルミノール溶液反応
(6)フィルム検出（たいていは～１分）
★参考資料
・ピアス社、LightShift Chemiluminescent EMSA kitマニュアル
・プロメガ社、Gel Shift Assay Systemsマニュアル
・オリンパス社、FCS を用いた核酸とタンパク質の相互作用プロトコール
・他、EMSAを行っている論文いくつか
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)： ゲルシフトアッセイ
★基本的な仕組み
DNAとタンパク質の結合を見る。
★使い道
ある遺伝子のプロモーター領域に特定の転写因子が結合するかどうかをみる。
プロモーターアッセイと併用し、ある遺伝子発現制御が特定の転写因子によって制御されていることをいう場合につかう。
ある細胞への刺激で、特定のDNA配列へ結合する転写因子が核移行するかどうかをみる。
★原理
タンパク質-DNA複合体がフリーのDNA断片(あるいは2本鎖オリゴヌクレオチド)より非変性ポリアクリルアミドゲルにおける移動度がより小さいという泳動度の違いでDNAとタンパク質が複合体を形成しているかどうかをみます。
ゲルシフトアッセイは精製したタンパク質、またはタンパク質混合液(例えば核または細胞抽出液)を、タンパク質結合サイトと考えられる配列を含むDNA断片（プローブ）とインキュベートすることで行ないます。
このプローブオリゴヌクレオチドは末端をラベル（32PなどのRI標識や、DIG・Biotinなどのnon RI標識）されており、RIラベルの場合は直接フィルムを使いオートラジオグラフィーで、non RIラベルの場合は抗ジゴキシゲニン-ALP（DIGラベル）やストレプトアビジン-HRP（Biotinラベル）を用いて以下化学発光させ検出します。
結合サイトと思われる配列に対するDNA結合タンパク質の特異性は、
（１）試験するタンパク質への結合サイトを含むDNA断片またはオリゴヌクレオチドで、標識していないものを過剰量添加するコンペティション試験、
（２）サンプルタンパク質を増量することで濃度依存的にシフトしたバンドが濃くなることを確認
（３）標的タンパク質への特異的抗体を泳動前に反応させ、DNA-タンパク質-抗体複合体を形成させ、さらに移動度が小さくなるか（スーパーシフト）確認
（４）タンパク質結合サイトと考えられる配列を一部変異させたDNA配列を用いた場合に結合しない（シフトしない）ことを確認
することで見ることができます。
★必要な試薬
・TENバッファー
10 mM Tris（pH 8.0）
1 mM EDTA
0.1 mM NaCl
・TBE 10X buffer (1L)
107.80g Tris base
55g boric acid
7.44g disodium EDTA?2H2O
・10X Binding Buffer
100 mM Tris（pH 7.5）
500 mM KCl
10 mM DTT
★プロトコールフローチャートと各ステップのおおよその所要時間 （具体的な方法は後述）
１．オリゴヌクレオチドのラベリングとアニーリング （１０分）
２．オリゴヌクレオチド-タンパク複合体の形成（ゲルシフト反応 [Binding reaction]）（３０分）
３．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１時間）
４．ブロッティングとクロスリンク(架橋)（４５分）
５．化学発光検出 （１時間）
★具体的な操作方法と注意点
０．非変性ポリアクリルアミドゲル（PAGEゲル）作成
EMSAを行う前日にキャストし、十分に重合させておく。
・４％PAGEゲル (20ml)
×１０TBE 1.0ml
30% (37.5:1)アクリルアミド：Bisアクリルアミド 2.8ml
40% アクリルアミド 125ul
80% グリセロール 625ul
蒸留水 15.5ml
10% APS 150ul
TEMED 10ul
ウェスタンブロットのゲルと違い、スタッキングゲルはありません。
ウェスタンブロットのゲルと同じく空気に触れているところは固まらないので、わたしはキャストしたらそのまま大きめの水槽に入れて、蒸留水（または脱イオン水）で水没させてます。
１．オリゴヌクレオチドのアニーリング
Biotinラベルの場合、PCRプライマー注文とほぼ同じで末端Biotinラベルにチェック。
逆相カートリッジカラム精製でオーダー。
結合サイトと思われる配列＋上下数ベースの２０～３０merでプローブ作製。（どれくらいのベースがいいかはまだわかりません。）
senseとanti-sense両方を注文し、それらをアニールする。
標識はsenseまたはanti-sense片側だけでもOK。
(1)注文した１本鎖オリゴヌクレオチドをTENバッファーに溶解。
(2)senseとanti-senseオリゴヌクレオチドの一部を等モル混合。
(3)94℃で10分間インキュベート。
(4)ゆっくりと室温まで冷却。（チューブをヒートブロックに入れたままそのままブロックごとテーブルに放置し、自然冷却）
(5)所定濃度に希釈（ラベル：20fmol/ul、アンラベル（ラベルの200倍）：4pmol/ul）
２．オリゴヌクレオチド-タンパク複合体の形成
タンパク質-DNA結合反応は結合用バッファーや温度に大きく影響されます。
* 精製されたDNA結合タンパクを用いる場合、非特異的な競合DNAを低濃度で使用するか、あるいは使用する必要はありません。
* クルードな抽出試料中のファクターを解析する場合、結合反応に非特異的な競合DNAを加えることが絶対に必要です。
* 結合反応によっては、異なる反応温度(4 ℃から37℃の範囲)が必要となることがあります。
* 塩濃度やpHがタンパクとDNAとの相互作用に影響することが知られています。
形成される複合体が特異的か非特異的かは、バッファーの条件に依存します。
したがって、Mg2+, Zn2+, Ca2+, 界面活性化剤やスペルミジンなどを追加で使用することも重要となることがあります。
過去の論文で同じ転写因子でEMSAしている論文があれば、それの条件を参考にする。
* poly-L-lysineは、特異的なタンパク/DNA複合体の形成を個々の反応において最適化させます。これは塩基性ペプチドがDNAとの親和性を高める可能性もあるからです。
アルブミンも同様に特異的なタンパク/DNA複合体の形成を良くするために用いる事が出来ます。
* プローブと核タンパクとを添加する順序が、形成されるタンパク-DNAの特異性を決定することがあります。
（通常は、poly (dI・dC)+タンパクサンプルを混ぜ何分か反応、その後プローブ添加しBinding reaction）
核タンパクサンプルを用いる場合、核タンパク抽出液は塩濃度が非常に高いため、反応系中でボリウムが増えすぎると持ち込む塩濃度が高くなりすぎるため、多くても系の1/10量にとどめておく方が無難。
(1)氷上で以下の内容物を混合（トータル量：20ul）
終濃度 量
ulrtapure water --- 10ul
10× Binding Buffer 1× 2ul
50% Glycerol 2.5% 1ul
100mM MgCl2 5mM 1ul
1ug/ul Poly(dI・dC) 50ng/ul 1ul
1% NP-40 0.05% 1ul
unlabeled probe 4pmol 1ul
タンパクサンプル 2ug 2ul
Biotin-label probe 20fmol 1ul
(2)室温でインキュベート。
３．PAGEゲル電気泳動（１時間）
（２）のBinding reactionを行っている間にあらかじめゲルのpre-runを行っておく。（0.5 × TBEバッファー、１００V、３０分～１時間）
SDSなどの界面活性剤が混入すると、複合体が分離されるため、western blotで使ったシステムを使う場合、特に念入りに洗ってから使う。
(1)ウェル洗浄
(2)それぞれの試料にブロモフェノールブルー（BPB）を含むローディングバッファーを 5ul添加。
(3)ウェルにアプライ（20ul）
(4)電気泳動（～100V、BPBがゲルの下部2/3～3/4程度まで泳動：BPBの付近にフリープローブが移動している）
(5)電気泳動中に次の転写準備
・ゲルと同じサイズに切ったナイロンメンブレンを、トランスファー用バッファー(0.5 × TBEバッファー)中で少なくとも１０分間平衡化
・ゲルと同サイズのワットマン3mm濾紙を４枚用意し、トランスファー用バッファーにつけておく。
・スポンジもトランスファー用バッファーにつけておく。
４．ブロッティングとクロスリンク(架橋)（４５分）
ここも（３）と同じく、western blotと共用する場合は洗浄を念入りに。（とくにスポンジ）
転写バッファーも0.5 × TBEバッファー。
クロスリンクはPCRゲル観察用のUVトランスイルミネーター上に転写したメンブレンをおいて１５分UV照射が簡単。
(1)電気泳動後、ゲルから片側ガラス板を注意深く取り外す。（スペーサーをこじるかんじで、ウェルの枠がこびりつきやすいので注意）
(2)タンク式の場合、下図のように積層し、気泡を抜く。
(3)380mA、30分転写（できるだけ低温で。ウェスタンブロットのウェット転写よりも電流変動はしにくい。）
(4)転写終了後、メンブレンの転写面を下にしてUVトランスイルミネーターで１５分UV照射。
５．化学発光検出
メンブレンは乾燥しないようにする。
注意点は、ウェスタンブロットのケミルミステップと同等。
(1)１５分ブロッキング
(2)ストレプトアビジン-HRPと反応させる（１５分）
(3)メンブレン洗浄（５分×４回）
(4)substrate equilibration buffer（Pierce社LightShift Chemiluminescent EMSA kitの場合）で５分。
(5)ルミノール溶液反応
(6)フィルム検出（たいていは～１分）
★参考資料
・ピアス社、LightShift Chemiluminescent EMSA kitマニュアル
・プロメガ社、Gel Shift Assay Systemsマニュアル
・オリンパス社、FCS を用いた核酸とタンパク質の相互作用プロトコール
・他、EMSAを行っている論文いくつか
うれしくて、言いたくてしょうがないんでしょうね。
なんだか、実験やっている人が読むと滑稽ですよ。
アメリカの生活に関したことにしぼった方が良いブログになると思います。(余計なお世話ですが。)
感想、ありがとうございます。
研究をしっかり行っている方には、そうなのかもしれません。
ブログって、想定読者をどうおくか難しいですね。
いただいたご意見は、今後の参考にさせていただきます。
これからもコメントおねがいします。
ぜひ、もっとプロトコール集を充実させていってほしいです。。
待ってる読者が私の周りにもいますよ～。
御覧頂きありがとうございます。
時間があれば実験関係のものを追加したいのですがちょっと...
期待しないで待っていてください。 (^^ゞ
参考にさせていただき、実際にやってみました。
核抽出を行った後、本法を参照し、泳動し、その後、SYPRO RUBY及びSYBR Goldでゲルを染色しました。
結果、アプライした位置から泳動があまりされませんでした。（かなり長い時間泳動したのですが…）
ゲル作りのコツとかありますでしょうか？
まだまだ、勉強が足りないため、間単にまとめてあるところがすごく助かります！
知らない言葉ばっかりで、全体像をつかむのにいつも時間がかかるので、こうゆう方が分かりやすいです★
これからも期待してます～
色々教えてください。
もしよかったらメールアドレスとか交換できないですか？
よろしくお願いします。
コメントありがとうございます。
このブログ、ほぼ放置モードに入っています。 (^^ゞ
メール、hiroyukikanzaki@mail.goo.ne.jpまでいただけますか？
よろしくどうぞ。
周りに知っている人がいないので大変参考になりました。
おかげさまで無事にデータも取ることができ、論文もアクセプトされました。
どうもありがとうございました。