バイオの故里から

バイオ塾主宰・Dr.Kawanoの日々、収集している情報(DB原稿)をバイオ塾メンバー向けて公開しています。

ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善

2016年11月05日 | BioTech生物工学 遺伝子工学
出願人: プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ, リウ,デービッド,アール., ギリンジャー,ジョン,ポール, パッタナヤク,ヴィクラム
発明者: リウ,デービッド,アール., ギリンジャー,ジョン,ポール, パッタナヤク,ヴィクラム

出願 2014-522918 (2012/07/22) 公開 2014-523747 (2014/09/18)

【要約】操作されたヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)等)は、ゲノム操作のための有望なツールであり、これらの酵素のオフターゲット切断部位の決定は大きな関心事である。本発明者らは、活性な二量体ヌクレアーゼ、例えば、ZFNおよびTALENにより切断され得る否かを、1011DNA配列について調べるin vitro選択法を開発した。本方法は、内在性ヒトCCR5およびVEGF−A遺伝子をそれぞれ標的とする、2つのZFNであるCCR5−224およびVF2468によりin vitroで切断され得る、一部はヒトゲノム中に存在する、数十万のDNA配列を明らかにした。培養ヒト細胞中に同定された部位の分析により、9つのオフターゲット遺伝子座でCCR5−224誘導の突然変異誘発が明らかになった。同様に、本発明者らは、培養ヒト細胞においてVF2468による31のオフターゲット部位の切断を観察した。本発明者らの発見は、過剰な結合エネルギーがオフターゲットZFN切断に寄与する、ZFN特異性のエネルギー補償モデルを確立し、将来のヌクレアーゼ設計の改善のための戦略を示唆する。さらに、TALENが、ZFNにおいて観察されたものと同様かまたはそれより高い切断特異性を達成することができることが観察された。
http://kantan.nexp.jp/%E7%89%B9%E8%A8%B1/t2014523747/
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